基因组表达连续分析SAGE的原理和实验路线
SAGE技术的原理主要基于两个关键点。首先，9到10个碱基的短核苷酸标签被认为具有足够的信息，可以唯一识别一种转录物。理论上，每个9碱基标签可以对应于人类基因组中估计的80000种转录物中的一种，作为转录物特征序列的代表。
其次，通过将这些标签集中在一个克隆中进行测序，并将连续的短序列数据输入计算机处理，可以对大量的mRNA转录物进行分析。SAGE的实验流程包括以下步骤：
- 首先，使用biotinylated oligo(dT)反转录cDNA，并使用限制性内切酶AE进行酶切，确保每个转录物至少有一个酶切位点。
- 将cDNA分为两部分，分别连接接头A或B，这两种接头含有标签酶和锚定酶的识别位点。
- 通过标签酶切割，生成9-10碱基的短片段，然后混合并连接两个cDNA池，形成双标签，进行扩增。
- 扩增产物经锚定酶处理，抽提双标签片段并克隆、测序。每个克隆至少包含10个标签，克隆数量通常在10到50个之间。
- 对标签数据进行处理，通过锚定酶序列确定标签的起始位置和方向，以计算机软件解析得到上千种基因表达产物的标签序列及其丰度。
尽管SAGE技术能够广泛收集生物组织的基因表达信息，但低丰度的mRNA可能被遗漏。此外，接头干扰可能导致克隆中的标签数量不足和序列末端连接不完整。Powell的方法通过磁性生物素珠吸附引物，有效地减少了接头干扰的问题。
扩展资料
基因组表达连续分析技术是基于使用碱基标签代表转录物特征序列，并将核苷酸顺序以连续数据形式输入计算机中进行处理的分析技术。
基因组表达连续分析SAGE的优点和应用
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