G418筛选阳性克隆的优化方法有哪些？
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在优化G418挑选单克隆的过程中，一种策略是采用联合方法以提升阳性克隆的成功率。首先，通过套环法或刮除法配合有限稀释法，可以有效地处理可能存在的负面影响，即减少阴性克隆对阳性克隆的不利影响。在操作时，添加药物后，使用高倍显微镜观察，阳性克隆与阴性克隆的差异明显，可以通过记号笔对阳性克隆进行标记以便识别。
对于阴性克隆，采取刮除的方法移除，然后对阳性克隆进行消化，继续进行筛选培养。另一种方法是使用套环，将套环固定在阳性克隆周围，然后在套环内加入胰蛋白酶或EDTA进行消化。消化完成后的物质会被吸收到新的培养孔中进行培养。最后，通过有限稀释法，将这些阳性克隆分散到96孔板中进行精确筛选，确保每个孔只含有单一的阳性克隆。
通过这样的步骤，筛选过程更为精确和有效，提高了阳性克隆的获取率，确保实验的成功进行。
扩展资料
G418是一种氨基糖苷类抗生素 ,在分子遗传试验中,是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。它通过抑制转座子Tn601，Tn5 的基因,干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞产生毒素 ,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞 ,也包括原生动物和蠕虫。当neo基因被整合进真核细胞DNA后 ,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA ,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达 ,使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。G418的这一选择特性 ,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
不朱复方： G418通过干扰核糖体的功能而阻断细胞的蛋白合成,阳性克隆中因含有抗性基因可以存活. 由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质,所以筛选不能太早 一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选.随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降,所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液,这时药物浓度可以降至200ug/ml 加药后,在高倍镜下,阳性克隆和阴性克隆很容易辨认,在阳性克隆下用记号笔做个标记.然后刮除阴性克隆,消化阳性克隆后继续筛选培养,最后再用有限稀释法把阳性克隆在96孔板中筛选 一般经过4周左右的筛选,得到的阳性克隆才都比较稳定
勐海县19821365555： 在只有25mM的HEPES下G418如何配制? - ？
不朱复方： G418的用途及配制方法 G418 :白色粉末,融点138~144℃,溶于水、甲醇. 分子式 :C20H40N4O10 •2H2SO4 分子量 :692.71 比旋:+104o~+121o 水分:≤10% 吸光值:≤0.015 (280nm,1mg/ml), ≤0.1 (570nm, 100mg/ml) G418是一种氨基...
勐海县19821365555： G418原代细胞如何筛选 - ？
不朱复方： 博凌科为解答:分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体.外源基因进入细胞后,部分能够通过细胞质进入细胞核内,根据细胞类型,至多80%的进入 核内的外源DNA得到瞬时表达.极少数情况下,进入细胞的外源DNA通过...
勐海县19821365555： 筛选阳性克隆的方法和原理?我需要至少两种方法和原理,两种. - ？
不朱复方：[答案] 最常见的就是蓝白斑筛选,详细的楼主可参考这个http://baike.baidu.com/view/161221.htm 方法很多,除蓝白斑筛选外,像 菌落PCR验证:详见http://baike.baidu.com/view/4118663.htm 从细菌里提取质粒后双酶切验证:用构建重组质粒时的两种限制...
勐海县19821365555： 简述基因克隆的基本步骤 - ？
不朱复方： 1. 扩增目的基因,比如通过PCR的方法. 2. PCR扩增的序列可以通过酶切或者TOPO TA的方法插入到载体质粒. 3. 转染大肠杆菌 4. 筛选阳性克隆一般常采用蓝白克隆方法,就是在载体上,序列的插入位置本来是一个完整编码β-gal这个酶的序列,如果不被破坏,产生的酶可以降解细菌培养盘上的底物,形成蓝色产物.如果有目的序列插入,这个酶就不能表达,形成的克隆就是白色的.5. 挑取阳性克隆,测序确认无变异和方向后,扩增质粒,提纯质粒.
勐海县19821365555： 基因克隆筛选的几种方法和相关的技术特征有哪些 - ？
不朱复方： 这是一套通用方法,简单方便.利用目的基因筛选就要考虑各种情况,很麻烦:能否顺利表达(克隆载体不表达,原核真核,修饰定位、辅因子等等);是否便于筛选(抗生素筛选很方便,如果目的基因是酶、转录因子或结构蛋白,怎么筛选?);不能通用(每研究一种蛋白,就要换一种载体/宿主/筛选方法)...
勐海县19821365555： 什么叫阳性克隆筛选法? - ？
不朱复方：[答案] 目的建立一个简便、可靠的重组阳性克隆的筛选方法.方法应用扩增小鼠生精细胞凋亡相关基因时使用的引物,以基因重组扩增后得到的菌落为模板,直接进行PCR扩增.结果在筛选的阳性菌落中可扩增到与小鼠凋亡相关基因片段大...
勐海县19821365555： 什么叫阳性克隆筛选法? 请打击帮帮忙!! - ？
不朱复方： 这是一种分子生物学的方法. 比如,在大肠杆菌中导入一个目的基因,要怎样才知道有没有导入进去呢?所以要同时导入一个报告基因(目的基因和报告基因位于同一个载体上).导入了报告基因的大肠杆菌在含抑制性物质的培养基上就可以生长,而不含报告基因的大肠杆菌(就是转化失败的)就不能生长.这样过了两三天后,在培养基上看见的菌落就是阳性科隆.这一过程就是阳性科隆筛选.一般选用的报告基因像青霉素抗性基因,链霉素抗性基因等等. 如果还想了解得更详细,就去买本分子生物学实验书或入门书籍看看就明白了.
勐海县19821365555： 筛选阳性克隆 - ？
不朱复方： BamH 1 的酶切位点在tet上,所以酶切重组后,质粒就不会再表达四环素抗性抗性了,筛选阳性克隆要挑选在Amp平板上生长的菌株,而在Tet平板上生长的菌株是插入失败的.
勐海县19821365555： 【及时求助】请教肝癌SMMC - 7721细胞的稳定转染,采用G418筛选的浓度 - ？
不朱复方：博凌科为解答:由于每种细胞对G418的敏感性不同,而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同,所以在筛选之前,一定要确定G418的最佳筛选浓度.尽管文献上说特性明确的细胞系G418的最佳用量还是稳定的,但是由于实验室...
