T载体克隆实验准备
为了进行T载体克隆实验，首先需要进行一系列的准备工作。首先，确保所有的器具清洁，包括5个100ml的锥形瓶（其中一个小的备用），6副培养皿，3个小试剂瓶，以及接种环和涂布棒。
接下来，准备100ml的超纯水作为基本溶液。对于实验溶液，需要配置LB培养基300ml，其中液体部分为50ml+50ml，固体部分为100ml。此外，还需要0.1mol/L的CaCl2 10ml，Amp浓度为100mg/ml的溶液1ml，X-gal浓度为20mg/ml的1ml，以及IPTG浓度为200mg/ml的1ml。
大肠杆菌菌液的准备工作也至关重要，需要1ml的菌液。对于感受态细胞连接产物，需要4管，每管4 x 5微升，总共20微升，分成4份进行操作。目的基因T载体和T4连接酶的冲液也需要准备，10x的T4连接酶溶液需分配为4份，每份4微升，其中1微升、0.5微升、1微升各一份。
在实验过程中，所有器具的灭菌是必不可少的。这包括5个100ml锥形瓶（其中一个小的）、6副培养皿、3个小试剂瓶、接种环、涂布棒、10ml超纯水、LB培养基、1.5ml的EP管、大小枪头以及一套过滤用具（两副）。确保所有这些设备在使用前都经过严格的灭菌处理，以保证实验结果的准确性。
用原核载体克隆并表达一种生物中的某个基因(序列已知),这种生物若是一...
大肠就不一样，随便搞。克隆质粒非常非常多，一般选实验室有的，或容易得到的。表达载体也很多，pET系列，pGEX系列，pCold系列等；表达菌也很多，一般BL21系列就足够了，当然有特殊要求的可以在试试其他菌。好了，我说一下我的步骤。首先不管是真核还是原核的靶基因，只要对表达菌没有太大损伤，都能...
什么是基因克隆载体?
单独一个包含启动子、编码区和终止子的基因，或者组成基因的某个元件，一般是不容易进入受体细胞的。即使采用理化方法进入细胞后，也不容易在受体细胞内稳定维持。把能够承载外源基因，并将其带入受体细胞（host：cell）得以稳定维持的DNA分子称为基因克隆载体（gene：cloning：vector）。作为基因克隆载体一般...
分子克隆的基本方法
载体 所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。基因库的建造 特异基因的筛选 核酸序列测定 一、基因克隆的基本方法 一个典型的基因克隆实验，主要有以下操作和结果：（1）包括有目的基因在内的DNA片断插入另一个DNA分子（克隆载体，通常是环状的），形成重组DNA分子。（2）重组DNA分子...
求分子克隆具体实验步骤一份~~多谢各位大侠啦~
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的高温变性:模板DNA经加热至94℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的低温退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列...
请教在pMG36E载体上克隆外源基因问题
不进行诱导,外源基因也不会表达的.而载体上的抗性基因,应该是有一些组成型的启动子调控.下面有关于克隆载体和表达载体的比较,我们实验室以前为了能够检测到酶活,都是用pUC19来做表达的,因为pET系列有时候表达量太大了,会造成包涵体,反而检测不到活性变化.所以就是用的克隆载体来做表达的.克隆载体：大多...
基因克隆的基本步骤有哪些
由于基因组DNA较大，不利于克隆，因此有必要将其处理成适合克隆的DNA小片段，常用的方法有机械切割和核酸限制性内切酶消化。若是基因序列已知而且比较小就可用人工化学直接合成。如果基因的两端部分序列已知，根据已知序列设计引物，从基因组DNA 或cDNA中通过PCR技术可以获得目的基因。二、载体的选择：基因克隆...
克隆载体的克隆是什么意思
克隆载体是指用来承载外来DNA并将其传递到目标细胞中的DNA分子。它在分子生物学领域中被广泛应用，是基因工程的重要工具之一。克隆载体可以是噬菌体、质粒或染色体等分子，具体应用根据研究需要灵活选择。克隆载体的克隆过程主要包括酶切、连接和转化等步骤。首先，使用限制性内切酶切割载体和外源DNA，使它们的...
如何利用基因克隆的方法将一个耐盐基因导入水稻中?
1、首先，需要从耐盐植物中克隆出目标基因。可以通过PCR扩增、cDNA文库筛选等方法，从植物组织中提取目标基因的DNA序列。2、将目标基因插入适当的载体中。在选择载体时，需要考虑到宿主细胞的生长特性和稳定性，以及基因转移的效率和稳定性。常用的载体包括质粒、病毒等。3、将载有目标基因的载体转化至适宜...
应用COS质粒载体克隆外源基因的一般程序是什么?
满意答案噓、偸偸噯伱1级2008-10-26答：应用柯斯质粒作为载体克隆外源基因的一般程序是,先用特定的限制性核酸内切酶局部消化真核生物的DNA,产出相对分子质量较大的外源DNA片段,与经同样的限制酶切割过的柯斯质粒线形DNA分子进行体外连接反应.由此形成的连接产物群体中,有一定比例的分子两端各带一个cos...
基因克隆
前面了解了基因克隆使用的相关工具酶和载体,接下来,我们介绍基因克隆的实验流程。细分的话,包括以下10个步骤(表6)。 下面我们以lncRNA PVT1的克隆和表达,分别采用T\/A克隆,传统酶切-酶连克隆和无缝克隆进行示例。(1) T\/A克隆 T\/A克隆是把PCR片段与一个具有3’-T突出的载体DNA连接起来的方法(图15)。使用该...
闻试瑞诺： 应该是分子克隆用的载体,使用前是双链线性片段,上面有必要的测序或表达元件,两头是黏末端,各在3'有一个游离的T(故名T载体).因为PCR实验中用的聚合酶大部分都是taq和taq的同类酶,会在PCR产物的3'末端自动加一个A,这样PCR产物纯化之后无需酶切就可以与T载体连接,连接结果为带有目的片段的环状质粒载体.之后转化挑克隆,进行表达和测序.
三亚市19564857637： T载体的作用是什么?克隆时为什么要用T载体? - ？
闻试瑞诺： 我做过几个克隆,没用过T载体,直接将酶切后纯化的产物进行连接,照样可以连接成功,基本上都会有10-50个克隆长出来.我用的是Sal I和Nde I这两个酶切位点,似乎这两个都是平端的哦.
三亚市19564857637： PCR产物克隆实验操作步骤? - ？
闻试瑞诺： 平端连接,通常情况下,PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接,但其连接效 率效低.因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性,能 在两6条DNA链的3＂末端加上一个多余的碱基,使合成的PCR产物成为 3＂突出一个碱基的...
三亚市19564857637： 什么是T载体 - ？
闻试瑞诺： 通过克隆甘露聚糖酶基因到pMD-18T载体构建了质粒pMD-18Tman2XcmI,克隆的甘露聚糖酶基因两侧各引进了一个特定的XcmI 酶切位点;用XcmI酶切质粒pMD-18Tman2XcmI可以制备T载体.因为甘露聚糖酶基因作为填充片段和筛选标记受半乳...
三亚市19564857637： 基因克隆的步骤是什么? - ？
闻试瑞诺： 不知道大家对基因克隆方面的技术了解多少,经过较长时间的总结和实践,有了一些自己的体会,拿出来与大家分享一下,给大家做一个抛砖引玉的作用吧. (1)是酶切位点的选择.我的实验室有三种常用的酶,在设计PCR产物的酶切位点之前...
三亚市19564857637： pcr产物的t - vector克隆方法,应注意哪些操作环节 - ？
闻试瑞诺： 1 平末端的PCR产物,首先需要用普通的taq酶让其末端加上A(一般跑完PCR,直接加少量普通taq,72度继续20-30min,就行了,如果你不放心,可以纯化一下,然后按PCR体系加入taq,dATP,buffer等,72度,30min),然后和普通PCR产物一样进行TA克隆; 2 具体的克隆方法,参考所用T载体的说明书.比如TAKARA的pMD-19T,里面有详细的介绍和注意事项.最重要的就是要注意目的片段和载体间的摩尔比要合适(一般3-8:1)
三亚市19564857637： 怎样设计引物克隆已经构建好的t载体基因来构建表达载体 - ？
闻试瑞诺： 如果t载体上没有表达载体上需要的酶切位点,就要重新设计带酶切位点的引物,PCR扩增t载体后酶切并连表达载体.如果t载体上有需要的酶切位点,直接酶切后回收目的片段,连接表达载体即可.
三亚市19564857637： 求分子克隆具体实验步骤一份~~多谢各位大侠啦~ - ？
闻试瑞诺： 分子克隆实验流程 第一天 一:目的片段的扩增(PCR) PCR反应的基本成分包括:模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液.PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的高...
三亚市19564857637： 如何提高PCR产物克隆的效率 - ？
闻试瑞诺： 【TA 克隆的优缺点】1、优点:(1)是目前克隆 PCR 产物最简便、快捷的方法.(2)不需使用含限制酶序列的引物,不需将 PCR 产物进行优化,不需把 PCR 产物做平端处理,不需在 PCR 扩增产物上加接头,即可直接进行克隆.(3)TA克隆选...
三亚市19564857637： 基因表达载体构建步骤 - ？
闻试瑞诺： 你的问题真的不知如何回答. 超表达载体的构建: 设计引物加接头,扩增目的基因,连接到T载体上测序.正确无误,切下来,酶切载体质粒与目的基因连接,阳性克隆鉴定,测序无误后构建完毕
