化学诱变剂ntg属于什么筛选方法

超诱变剂NTG指什么？~

NTG诱变是亚硝基胍，分子式: CH4N4O
NTG诱发的突变主要是GC—AT转换,另外还有小范围切除、移码突变及GC对的缺失.在自然条件下NTG容易分解,而在酸性(pH5.5)条件下会产生HNO2.虽然HNO2本身就是诱变剂,但在NTG有活性时(pH6~9),它却无诱变效果.在碱性条件下,NTG会形成重氮甲烷(CH2N2),它是引起致死和突变的主要原因.它的效应很可能是CH2N2对DNA的烷化作用引起的。

　　诱变育种的操作要点

　　（一）出发菌株的选择
　　用来进行诱变的菌株称为出发菌株。诱变育种的目的在于提高微生物代谢产物的产量、改进质晕或产生新的代谢产物。因此，选择出发菌株对诱变效果尤为重要。
　　1.作为出发菌株疢对诱变剂敏感，变异幅度大。
　　2．从自然界分离到的野生型菌株，对诱变剂敏感，易发生正向突变。由自发突变经
　　筛选得到的菌株也属于野生型菌株。
　　3.经诱变处理获得的高产菌株再诱变时易出现负突变，继续提高产量较难，不易直接作出发菌株。
　　4.选择易于表现出基因发生改变的单倍体细胞，酵母菌二倍体细胞很稳定，应该挑选异宗接合的单倍体菌株或用子囊孢子进行诱变。
　　5.选择单核或细胞核少的细胞，在霉菌的诱变育种中，多采用分生孢子或孢子囊孢
　　子进行诱变处理。

　　(二）细胞悬液的制备

　　1.采用生理状态一致的单细胞或单孢子进行诱变处理，不可能使细胞均匀地接触诱
　　变剂，还可以减少分离性表型延迟现象的发生。因此，诱变处理前的细胞应尽可能达到同步培养和对数生长期状态。
　　2． 一般诱变处理真菌孢子或酵母菌营养细胞，其细胞悬液浓度应为106个/ml而细菌营养细胞或放线菌孢于浓度为108个/ml，细胞悬液浓度可用平板计数法和血球计数板法测定。
　　3.一般情况，使用物理诱变剂处理时，用生理盐水配制细胞悬液；而使用化学诱变剂处理时，由于pH变化易引起诱变剂性质的改变而都使用缓冲液配制细胞悬液。

　　(三）诱变剂和处理方法的选择

　　1.诱变剂的选择 对诱变剂的要求是使遗传物质改变大，难于产生回复突变，这样获得的突变株突变性状稳定。亚硝基胍(NTG)和甲基磺酸己酯(EMS)等烷化虽能引起高频度的变异，但它们多是引起碱基对转换突变，易发生回变；而能引起染色体大损伤或移码的紫外线、γ-射线等诱变剂，其有优越性能。

　　2.诱变剂量的选择 选择最适诱变剂量，也就是在提高突变率的基础上，即能扩大变异幅度，又能使变异向正向突变范围移动的剂量。研究方向正向突变多出现在偏低剂量中，形态变异多发生在偏高剂量中，而一般形态变异多趋向于降低产量。
　　3.诱变处理方法的选择
　　（1）紫外线与光复活的交替处理 能使紫外线诱变作用得到显著增强。多次紫外线照射后，并在每次照射后进行-次光复活，突变率将大大提高。
　　（2）诱变剂的复合处理有一定的协同效应，复合处理有以下几种方式：两种或多种
　　诱变因子先后使用；同—种诱变剂重复使用；两种或两种以上诱变剂的交替使用等。

　　(四）中间培养

　　突变基因的出现并不意味着突变表型的出现，表型的改变落后于基因型改变的现象，称为表型延迟。其原因是分离性延迟和生理性延迟造成的。为此，必须将诱变处理的菌液进行中间培养，即将菌液接入完全液体培养基中培养过夜。

　　（五）突变株的分离
　　1.营养缺陷性菌株的分离

　　（1）淘汰野生型、浓缩缺陷型
　　（2）缺陷菌株的检出
　　（3）营养缺陷型的鉴定

　　2.抗性突变菌株的分离
　　（1）抗药性突变株的分离
　　（2）抗代谢结构类似物突变菌株的分离

　　3.产量性状突变的分离

已知的有烷化剂、碱基类似物(base analog)、羟胺(hydroxylamine)、吖啶色素等. 常用化学诱变剂的种类及作用机制 （一）烷化剂 是栽培作物诱发突变的最重要的一类诱变剂.药剂带有一个或多个活泼的烷基.通过烷基置换,取代其它分子的氢原子称为"烷化作用"所以这类物质称烷化剂. 烷化剂分为以下几类： 1. 烷基磺酸盐和烷基硫酸盐 代表药剂：甲基磺酸乙酯（EMS）、硫酸二乙酯（DES） 2. 亚硝基烷基化合物 代表药剂：亚硝基乙基脲（NEH）、N-亚硝基-N-乙基脲烷（NEU） 3. 次乙胺和环氧乙烷类 代表药剂：乙烯亚胺（EI） 4. 芥子气类 氮芥类、硫芥类 烷化剂的作用机制--烷化作用 作用重点是核酸,导致DNA断裂、缺失或修补. （二）核酸碱基类似物 这类化合物具有与DNA碱基类似的结构. 代表药剂： 5-溴尿嘧啶（BU）、5-溴去氧尿核苷（BudR） 为胸腺嘧啶（T）的类似物 2-氨基嘌呤（AP） 为腺嘌呤（A）的类似物 马来酰肼（MH） 为尿嘧啶（U）的异构体 作用机制：作为DNA的成份而渗入到DNA分子中去,使DNA复制时发生配对错误,从而引起有机体变异. （三）其它诱变剂 亚硝酸 能使嘌呤或嘧啶脱氨,改变核酸结构和性质,造成DNA复制紊乱.HNO2还能造成DNA双链间的交联而引起遗传效应. 叠氮化钠(NaN3) 是一种呼吸抑制剂,能引起基因突变,可获得较高的突变频率,而且无残毒. 以下是具体的使用方法,希望对你有点作用! 化学诱变剂的剂量主要决定于其浓度和处理时间. 化学诱变剂都具毒性,其中90%以上是致癌物质或极毒药品,使用时要格外小心,不能宜接用口吸,避免与皮肤直接接触,不仅要注意自身安全,也要防上污染环境,造成公害. 一、碱基类似物用于诱发突变的碱基类似物有5-BU、5-FU、BUdr、5－IU等他们是胸腺嘧啶的结构类似物,AP、6-MP是腺嘌呤的给、结构类似物.最常用是5－BU和AP. 当将这类物质加人到培养基中,在繁殖过程中可以掺人到细菌DNA分子中,不影响DNA的复制.它们的诱变作用是取代核酸分子中碱基的位置,再通过DNA的复制,引起突变,困此,也叫掺人诱变剂.显然这一类诱变剂要求微生物细胞必顿处在代谢的旺盛期,才能获得最佳的诱变效果. （一）碱基类似物的诱变机制正常的碱基存在着同分异构体,互变异构现象在嘧啶分子中以酮式和烯醇式的形式出现,而嘌呤分子中以氨基和亚氨基互为变构的形式出现、一般互变异构现象在碱基类似物中比正常DNA碱基中频率更高. 5-BU 导致A：T碱基对转换为GC碱基 2-氨基嘌呤也可以诱发DNA分子中A：T－ G：C或G：C－ A：T的转换. （二）碱基类似物的诱变处理方法（以5-BU为例） 1．单独处理将微生物液体培养到对数期．离心除去培养液,加入生理盐水或缓冲液．饥饿培养8-10h,消耗其体内的贮存物质、将5-BU加入到经饥饿培养的培养液中,处理浓度为25-40ug／ml,温合均匀．取0.1-0.2ml菌悬液加人到琼脂培养基上涂布培养.在适宜温度下,使之在生长过程中诱变处理.培养后挑取单菌落,进行筛选.如果是处理真菌、放线菌孢子,则要提高5-BU的浓度,常处理浓度为 0.1mg／ml. 2．与辐射线复合处理据报道；如果菌体先用5-BU等碱基类似物进行处理,使它们首先渗人到DNA分予中,然后用辐射线照射,诱变效果会比单独使用射线要好.因此碱基类似物也是一种辐射诱变的增敏剂.从而提高突变率. 二、烷化剂（一）烷化剂的作用机制烷化剂分单功能烷化剂和双功能或多功能烷化剂两大类.前者仅一个烷化基团,对生物毒性小,诱变效应大.后者具有两个或多个烷化基团,毒性大,致死率高,诱变效应较差.主要原因是双功能烷化剂有硫芥、氮芥. 烷化剂主要是通过烷化基团使DNA分子上的碱基及磷酸部分烷化,DNA复制时导致碱基配对错误而引起突变,碱基中容易发生烷化作用的是嘌呤类.其中鸟嘌呤N7是最易起反应的位点,几乎可以和所有烷化剂起烷化作用；此外,DNA分子中比较多的烷化位点是鸟嘌呤O6和胸腺嘧啶O4,这些可能都是引起突变的主要位点.其次引起烷化的位点是鸟嘌呤N3、腺嘌呤N2,腺嘌呤N7和胞嘧啶N3.这些位点引起碱基置换的仅占烷化作用的10％左右.因此,由这些位点改变所引起的突变仅是少数. 烷化剂也能造成磷酸和核糖之间的共价键断裂,而造成突变. （二）烷化剂的性质溶液烷化剂的性质比较活泼,不太稳定,在水溶液中容易发生分解.它们大部分半衰期很短,其长短与温反、溶液PH关系很大.因此,化学诱变剂要现用现配还要避光.配制烷化剂时,要采用合适的出缓冲液. 有毒! （三）常用的烷化剂亚硝基胍（NTG） 黄色晶体物质,性质不稳定,容易光解,黄色变为绿色时,诱变效应际低. 有超诱变剂之称,常用缓冲溶液有磷酸缓冲液和Tri缓冲液. 诱变处理方法： ①用一定值的磷酸缓冲液或Tri缓冲液洗制成菌悬液.②NTG母液：配制需加助溶剂甲酰胺或丙酮少许,然后加缓冲液,其比例为缓冲液9ml：NTG丙酮溶液lml,浓度为NTG 1mg/ml ；使用时取母液0.2ml + 菌悬液1.8ml,NTG终浓度为100ug/ ml.一般随菌种不同而异,细菌一般为100-1000 ug/ ml,放线菌、真菌为l000-3000 ug/ ml.③放线菌在生长适宜的温度下培养,（细菌30-35℃、真菌25-28℃、放线菌30-32℃）处理若干时间,一般细菌20-60min,孢子90-120 min④终止反应.冷的生理盐水50倍稀释处理,或经过离心洗涤处理,作一定稀释度分离于平皿.如果是细菌,把后培养基按一定浓度加入到菌体沉淀物中,振荡培养1.5-2h,经2-3次细胞分裂,再涂平皿. 处理完毕后,马上把接触过NTG的器皿用NaOH浸泡处理. NTG除以上直接以溶液处理外,还可以按以下方法诱变处理,摇瓶振荡处理：在接菌后的培养基中加人5-10 ug/ ml NTG．并加几滴吐温60或吐温80,使成乳化状（注意吐温对该菌生长是否有影响）；在平皿上生长过程处理：如果将NTG、琼脂和菌体混合制成平板,NTG浓度为10-50 ug/ ml.或将琼脂培养基制成平板．然后将NTG和菌体混合涂抹平析,此时NTG浓度为10-20 ug/ ml. 经后培养的培养液．除部分进行平皿分离外.剩余的培养液可以加人适量的药物,保存于冰箱内数天.如日本有人把经过NTG处理后的大肠杆菌培养液,用50％甘油（最终浓度为12.5％）于-40℃、-80℃保存.在以后数天内随时可取出融化,稀释分离,突变体死亡很少. 据报道．无论是用辐射处理,还是用化学诱变剂处理后的菌悬液或后增养液,浸在冰浴中2-3h,试验的重复性很好.认为在大肠杆菌、枯草杆菌和放线菌等可以采取这一措施来提高诱变效果. NTG是一种强烈致癌物质,操作时要带橡皮手套,穿工作服,带口罩,用称量瓶称量,最好在通风橱中进行.凡接触过NTG的器皿必须及时、单独处理,例用自来水大量冲洗或用1-2N的NaOH浸泡过夜,洗净. 2．甲基磺酸乙酯（简称EMS）甲基磺酸乙酯是磺酸酯类中诱变效果较好的一种烷基化合物,外观呈粉末状或无色液体,难溶于水,不稳定,易水解成无活性物质. EMS的诱变处理方法： ① EMS 母液的配制：为了安全和防上失效,配制前将需用的器皿,置冰箱内预冷,然后在冰浴中进行配制.取0.5ml EMS原液,加人到10 ml pH7.2磷酸缓冲液中,加盖,并轻轻转动试管.由于在水溶液中易失效,故尽可能低温保藏,并要现用现配. ②取新鲜的菌体,经前培养至对数期．离心洗涤,用缓冲液制成8 ml菌悬液（107-108ml-1）.对于丝状菌孢子,则前培养至萌动期,悬液含 106 ml-1. ③取EMS母液2ml,加人到以8ml的菌悬液中.在适宜温度下处理一定时间（根据预实验绪果确定）.处理的最终浓度为0 .lmol／L.对于真菌孢子,则为0.2-0.5rnol／L. ④EMS处理一定时间后,用50倍生理盐水稀释或加入一定量的2%NaS2O3溶液或多次离心、洗涤,以终止反应. EMS是剧毒的诱变剂,在整个诱变过程,包括配制药品、操作处理、保存等都要严守安全,不能接触皮肤,所有接触过EMS的器皿,单独用大量水冲洗洗涤,或用10％NaS2O3溶液浸泡过夜,再用清水冲洗干净. 三、脱氨剂亚硝酸是一稀常用的诱变剂,毒性小．不稳定,易挥发．其钠盐易在酸性缓冲液中产生NO和NO2 （一）亚硝酸的诱变机制脱去碱基中的氨基变成酮基,引起转换而发生变异.A→H,C→U,G→X. A：T→G：C和G：C→A：T.亚硝酸的诱变也可以发坐回复突变. 亚硝酸除了脱氨基作用外,还可引起DNA交联作用,DNA复制,从而导致奕变. （二）亚硝酸的处理方法 1．试剂的配制（1）1mol／L pH4.5醋酸缓冲液（2）0.1mol／L亚硝酸钠溶液（3）0.07mol／L pH8.6磷酸氢二钠溶液以上试剂用前均要灭菌. 2．处理方法取孢子悬液1 ml,pH4.5醋酸缓冲液2ml及硝酸钠溶液lml,最后处理浓度为0.025 mol／L ；25-26℃保温10-20min,加入的磷酸氢二钠溶液 20 ml,使出下降至pH 6. 8左右,以终止反应.稀释分离于平板. 如果是处理细菌,亚硝酸最后浓度以0.05 mol／L. 在亚硝酸处理菌体或孢子时要严格控制好温度,否则会影响诱变效果. 四、移码诱变剂移码诱变剂与DNA相互结合引起碱基增添或缺失而造成突变.它们主要包括吖啶黄、吖啶橙、ICR－171、ICR-191等.移码诱变剂对噬菌体有强烈的诱变作用,诱发细菌、放线菌的质粒脱落比其他诱变剂效果更为显著.如某些产生抗生素的放线菌.用处理后,发现产量明显下降,主要就是由于控制抗生素合成的质粒脱落造成的. 吖啶黄的性质和使用方法：淡黄色晶体,微溶于热水,溶于乙醇和乙醚,不稳定,见光易分解. 使用时,先用少许乙醇溶解,配成一定浓度的母液.通常处理方法是特它们加入培养基中,使最后浓度为10-50ug/ml,混合后制成平板,适温培养,在生长过程中处理.另外还可将吖啶黄加人到培养液中,浓度为10-20 ug/ml ,在适温条件下,振荡培养过程中处理. 五、羟化剂【以羟胺为例】羟胺的简称HA,常以盐酸羟胺形式存在,为白色晶体,溶于水,不稳定易分解,具腐蚀性. 1.羟胺的诱变机制当羟胺浓度为0.1-1.0mol／L pH6.0时,主要与胞嘧啶反应,使羟化的C与A配对,在0.1-1.0mol／L pH9.0,羟胺可以与鸟嘧啶反应,10-3 mol／L时,羟胺可以与胸腺嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶起反应.但据分析,羟胺与T、G反应的是它的产物,而不是它本身.此外,羟胺有时还能和细胞中其他物质作用产生过氧化氯,也具有诱变作用. 2．羟胺的处理方法常用浓度为0.1％-5％,可直接在溶液中处理,时间1-2h,然后分离培养.但一般都加到琼脂平板或振荡培养基中.然后接入孢 子或细菌,在适温下培养,生长过程中处理．所用浓度比直接处理时低些. 六、金属盐类用于诱变育种的金属盐类主要有氯化锂、硫酸锰等.其中氯化理比较常用,与其他诱变剂复合处理,效果相当显著. 氯化锂称之为助诱变剂,氯化锂是白色粉末,易溶于水,使用时通常加到培养基中. 为了速免受破坏．倒平板时,当培养基温度冷却到50-60℃时才加入制成平板,然后把细菌或孢子涂布分离,处理终浓度为0.3％-1.5%. 七、其他化学诱变剂 1．秋水仙素秋水仙碱是诱发细胞染色休多倍体的诱变剂.秋水仙碱的主要作用是破坏细胞有丝分裂过程中纺锤丝的形成.导致多倍体的产生. 2．抗生素作为诱变剂的抗生素主要有链黑霉素、争光霉素、丝裂霉素、放线菌素、光辉霉素和阿霉素等.这些抗生素都是抗癌药物,它们在微生物育种中虽有应用,但效果不如烷化剂等诱变剂显著,应用并不广泛.一般不单独使用,常与其他诱变剂一起复合使用. 八、直视化学诱变剂的操作安全化学诱变剂多数是极毒的致癌药品,在进行诱变操作后的处置以及诱变剂的保藏等方面的安全防护都是极其重要的.如有疏忽,就可能对健康和环境带来恶果,万万不可麻痹.

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