耐药试验简介

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目录

• 1 概述
• 2 药敏试验分类
• 2.1 纸片扩散法
• 2.2 稀释法
• 2.2.1 琼脂稀释法
• 2.2.2 肉汤稀释法
• 2.3 抗生素浓度梯度法
• 2.4 自动化仪器法
• 3 实验步骤
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 药敏试纸
• 3.1.2 细菌
• 3.1.3 仪器
• 3.2 实验准备
• 3.3 实验操作方法
• 3.3.1 药敏片法
• 3.3.2 牛津杯法
• 3.3.3 打孔法
• 3.4 结果观察
• 3.5 判定标准
• 3.6 影响药敏结果的因素
• 3.6.1 培养基
• 3.6.2 细菌接种量
• 3.6.3 药物浓度
• 3.6.4 培养时间
• 4 药敏试验的应用

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1 概述

耐药试验简称药敏试验（或药物敏感试验）。旨在了解病原微生物对各种抗生素的敏感（或耐受）程度，以指导临床合理选用抗生素药物的微生物学试验。一种抗生素如果以很小的剂量便可抑制、杀灭致病菌，则称该种致病菌对该抗生素“敏感”。反之，则称为“不敏感”或“耐药”。为了解致病菌对哪种抗菌素敏感，以合理用药，减少盲目性，往往应进行药敏试验。其大致方法是：从病人的感染部位采取含致病菌的标本，接种在适当的培养基上，于一定条件下培养；同时将分别沾有一定量各种抗生素的纸片贴在培养基表面（或用不锈钢圈，内放定量抗生素溶液），培养一定时间后观察结果。由于致病菌对各种抗生素的敏感程度不同，在药物纸片周围便出现不同大小的抑制病菌生长而形成的“空圈”，称为抑菌圈。抑菌圈大小与致病菌对各种抗生素的敏感程度成正比关系。于是可以根据试验结果有针对性地选用抗生素。近年已有自动化的药敏试验仪器问世，使试验更加迅速、准确。目前滥用抗生素，致使抗药菌增加，甚至因长期大量使用广谱抗生素，杀伤体内正常微生物，失去微生物的相互制约作用，从而使一些少见的或一般情况下的非致病菌大量繁殖，引起所谓“二次感染”的情况屡有发生，给治疗造成人为的困难。因此，提倡使用药敏试验，坚持合理用药十分重要。

2 药敏试验分类

2.1 纸片扩散法

该法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成浓度梯度。同时，纸片周围抑菌浓度范围内的菌株不能生长，二抑菌范围外的菌株则可以生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈，不同的抑菌药物的抑菌圈直径因受药物在琼脂中扩散速度的影响而可能不同，抑菌圈的大小可以反映测试菌对药物的敏感程度，并与该药物对测试菌的MIC呈负相关。

2.2 稀释法

稀释法药敏试验可用于定量测试抗菌药物对某一细菌的体外活性，分为琼脂稀释法和肉汤稀释法。实验时，抗菌药物的浓度通常经过倍比（lg2）稀释，能抑制待测菌肉眼可见生长的最低药物浓度成为最小抑菌浓度（MIC），一个特定抗菌药物的测试浓度范围应该包含能够检测细菌的解释性折点（敏感、中介和耐药）的浓度，同时也应该包含质控参考菌株的MIC.

2.2.1 琼脂稀释法

首先制备含抗菌药物的琼脂稀释平板。再接种待测菌株，然后是结果判读。

2.2.2 肉汤稀释法

2.3 抗生素浓度梯度法

2.4 自动化仪器法

3 实验步骤

3.1 实验材料

普通营养琼脂培养基：可去生化试剂店购买，做不同细菌的药敏试验可选择不同的培养基，如做大肠杆菌的药敏试验可选择普通营养琼脂或麦糠凯培养基。做沙门氏菌可选择血清培养基。

3.1.1 药敏试纸

购买或自制（详见实验准备）

3.1.2 细菌

待做药敏试验的细菌

3.1.3 仪器

接种环、酒精灯、打孔器、牛津杯、移液器、滴头

3.2 实验准备

药敏片的准备：购买或自制

制备方法：取新华1号定性滤纸，用打孔机打成6毫米直径的圆形小纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎。经15磅1520分钟高压消毒后，放在37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。

抗菌药纸片制作：在上述含有50片纸片的青霉素瓶内加入药液0.25毫升，并翻动纸片，使各纸片充分浸透药液，翻动纸片时不能将纸片捣烂。同时在瓶口上记录药物名称，放37℃温箱内过夜，干燥后即密盖，如有条件可真空干燥。切勿受潮，置阴暗干燥处存放，有效期36个月。

药液的制备（用于商品药的试验）：按商品药的使用治疗量的比例配制药液；如商品药百病消按其说明量治疗量0.01%饮水，可按这个比例配制药液，可取10毫克加入10毫升的水中混匀。此稀释液即为用于做药敏试验的药液。

3.3 实验操作方法

3.3.1 药敏片法

在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密）

将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。为了使能准确的观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上；一般可在平皿中央贴一片，外周可等距离贴若干片（外周一般可贴七片），每种药敏片的名称要记住。

将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。

3.3.2 牛津杯法

在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密。）

以无菌操作将灭菌的不锈钢小管（内径6nm、外径8nm、高10nm的圆形小管，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，并在小管处标记各种药物名称。每个平板可放46支小管。待分钟后，分别向各小管中滴加一定数量的各种药液，勿使其外溢。置37℃培养818小时，观察结果。

将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。

3.3.3 打孔法

该法较简单，成本低，易操作，比较适用于商品药物的检测。

在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密。）

以无菌操作将灭菌的不锈钢小管（外径为4毫米、孔径与孔距均为3毫米，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培养基上打孔，将孔中的培养基用针头挑出，并以火焰封底，使培养基能充分的与平皿融合（以防药液渗漏，影响结果）。

加样：按不同药液加样，样品加至满而不溢为止。

将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。

3.4 结果观察

在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，其浓度呈梯度递减，因此在纸片周围一定距离内的细菌生长受到抑制。过夜培养后形成一个抑菌圈，抑菌圈越大，说明该菌对此药敏感性越大，反之越小，若无抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。其直径大小与药物浓度、划线细菌浓度有直接关系。

3.5 判定标准

药敏实验的结果，应按抑菌圈直径大小作为判定敏感度高低的标准。

表1　药物敏感实验判定标准

抑菌圈直径（毫米） 敏感度

20以上 极敏

15~20 高敏

10~14 中敏

10以下 低敏

0 不敏

药物敏感实验判定标准参考表

1，多黏菌素抑菌圈；在9毫米以上为高敏，6—9毫米为低敏，无抑菌圈为不敏。

3.6 影响药敏结果的因素

3.6.1 培养基

应根据试验菌的营养需要进行配制。倾注平板时，厚度合适（约56mm），不可太薄，一般90mm直径的培养皿，倾注培养基1820ml为宜。培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP的活性。

3.6.2 细菌接种量

细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。

3.6.3 药物浓度

药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制。商品药应严格按照其推荐治疗量配制。

3.6.4 培养时间

一般培养温度和时间为37℃ 818小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好抗菌药的平板培养基，先置4℃冰箱内2~4小时，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较大的抑菌圈。

4 药敏试验的应用

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疏附县13279404956： 药敏试验. - ？
竹哈肝素： 简称药敏试验(或耐药试验).旨在了解病原微生物对各种抗生素的敏感(或耐受)程度,以指导临床合理选用抗生素药物的微生物学试验.一种抗生素如果以很小的剂量便可抑制、杀灭致病菌,则称该种致病菌对该抗生素“敏感”.反之,则...

疏附县13279404956： 药物皮内实验的临床意义是什么?药物皮内实验的临床意义是什么, ？
竹哈肝素： 药物敏感试验简称药敏试验(或耐药试验).旨在了解病原微生物对各种抗生素的敏感(或耐受)程度,以指导临床合理选用抗生素药物的微生物学试验.目前常用的药敏试验方法有:纸片琼脂扩散法(K-B法)、稀释法、E试验、检测细菌耐药性的方法.稀释法分液体稀释法和琼脂稀释法.检测细菌耐药性的方法包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的检测、耐万古霉素肠球菌(VER)的检测、耐青霉素肺炎链球菌(PRP)的检测、超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的检测和β-内酰胺酶的检测.

疏附县13279404956： 抗菌药物敏感试验(AST)的意义是什么? ？
竹哈肝素： 抗菌药物敏感试验(AST)的意义1.可预测抗菌治疗的效果即试验结果为“敏感”时治疗可能有效;结果为“耐药”时使用该药物治疗肯定无效.2.指导临床医生选择使用抗生素AST的结果往往在给予病人经验性治疗24h~48h之后出现,若结果为“敏感”,说明治疗有效,若结果为“耐药”,经验性治疗无效,应尽快更换敏感的药物.3.提供所选择药物的依据.4.监测耐药性,分析耐药性的变迁,掌握耐药菌感染的流行病学,控制和预防耐药菌感染的发生和流行.

疏附县13279404956： 如何在体外检测细菌耐药机制? ？
竹哈肝素： 可有多种方法检测细菌的耐药机制,药敏试验结果可提示存在某种耐药机制,如 苯唑西林耐药提示细菌可能产生PBP蛋白突变;三代头孢耐药推测产ESBLs等,也可用 一些简单特殊方法可直接检测耐药机制如:用头孢硝噻吩水解试验检测β-内酰胺酶;用 分子生物学技术检测耐药机制是现代研究的主要方法如:检测引起葡萄球菌对苯唑西林耐 药的mecA基因;用基因序列测试发方法区别不同的产酶机制.

疏附县13279404956： 简述临床微生物学实验室进行体外抗菌药物敏感试验的目的和指征. - ？
竹哈肝素： 1.对其敏感性不能预测的临床分离菌株必须常规进行药敏试验,以供临床选择治疗药物时参考.2.临床因疗效差而考虑更换抗菌药物时,应对拟选药物进行药敏试验.3.了解所在医院或地区常见病原菌耐药性的变迁情况,定期通报临床,有助于临床的经验治疗选药.4.评价新抗菌药物的抗菌谱和抗菌活性等药效学特性.5.对细菌耐药谱进行分析和分型有助于某些菌种的鉴定,并作为医院感染流行病学调查的手段之一.当然在包括我们医院的绝大多数医疗机构,只要分离出有临床意义的微生物,都进行药敏试验

疏附县13279404956： 什么叫天然耐药?什么叫天然耐药,了解天然耐药有什么意义? ？
竹哈肝素： 细菌耐药可分为天然耐药(也称固有耐药)和获得性耐药.天然耐药是由染色体决定的,菌种整体上(几乎全部分离株)都表现为耐药特性.不同细菌细胞结构与化学组成...

疏附县13279404956： 目前结核分枝杆菌耐药性检测方法有哪些? ？
竹哈肝素： 目前临床正在使用和研究的耐药性检测方法归纳起来,有表型检 测和基因检测两大类.表型检测方法有常规药敏试验方法、BACTE- CTB-960放射性液体培养基法、噬菌体生物扩增法、荧光素酶信号噬菌 体法(LRP)、MTT法、流式细胞仪(FCM)测定法等.基因检测方法有 直接测序法(DS)、聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)、 PCR-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)、双脱氧指纹图法 (ddF)、反向系列探针杂交法(AiPA)、异源双链形成法(HDF)、随机扩 增多态性DNA(RAPD)基因分型技术等.

疏附县13279404956： 耐药性与耐受性有何区别? ？
竹哈肝素： 耐药性又称抗药性,是指病原体对于药物的抵抗性.在治疗细菌感 染性疾病或寄生虫病时,长期使用某种药物,病原体反复与之接触后,其 反应性逐渐减弱,以致最后病...

疏附县13279404956： 药敏试验的结果应如何解释? ？
竹哈肝素： 不论是抑菌圈的量取或MIC、IC值读取,根据NCCLS标准,最终以“敏感”、“耐药”和“中介”报告.药敏试验中,“敏感”表示测试菌可被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制或杀死.“耐药”表示测试菌不能被体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制,临床治疗无效.“中介”者提示该细菌对常规用药体液或组织中的药物浓度的反应率低于敏感株,但在一些药物生理浓集的部位(如尿液中的喹诺酮类)或者使用高于正常给药量(如β-内酰胺类)临床上使用有疗效.

疏附县13279404956： HBV耐药变异的相关概念是什么? ？
竹哈肝素： 病毒学耐药 出现某种特定的关键耐药变异,同时有病毒定量反跳大于一个log10拷贝/毫升或治疗中HBV DNA从“测不到”上升至检测限以上;亦称之为HBV DNA的反弹(rebound)或突破(breakthrough).