绿色荧光蛋白在细胞生物学中有哪些应用

绿色荧光蛋白在细胞生物学中有哪些应用？~

绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用。
由水母Aequorea victoria中发现的野生型绿色萤光蛋白，395nm和475nm分别是最大和次大的激发波长，它的发射波长的峰点是在509nm，在可见光绿光的范围下是较弱的位置。由海肾(sea pansy)所得的绿色萤光蛋白，仅有在498nm有一个较高的激发峰点。
在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色萤光蛋白基因常被用作为一个报导基因(reporter gene)。一些经修饰过的型式可作为生物探针，绿色萤光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物(例如:兔子上进行表现，并拿来映证某种假设的实验方法。
GFP的性质
GFP荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强，特别在450～490nm蓝光波长下更稳定。
GFP需要在氧化状态下产生荧光,强还原剂能使GFP转变为非荧光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂并不影响GFP荧光。中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等。
GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析。但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白。
由于GFP荧光是生物细胞的自主功能,荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。
GFP在肿瘤发病机制研究中的应用
GFP 是一个分子量较小的蛋白,易与其他一些目的基因形成融合蛋白且不影响自身的目的基因产物的空间构象和功能。GFP 与目的基因融合,将目的基因标记为绿色,即可定量分析目的基因的表达水平,显示其在肿瘤细胞内的表达位置和量的变化,为探讨该基因在肿瘤发生、发展中的作用及其分子机制提供便利条件。
在肿瘤的形成过程中,增殖和凋亡是一对相互矛盾的统一体。若肿瘤细胞凋亡占优势,肿瘤组织将长期处于休眠状态或自行消亡。肿瘤细胞的凋亡受凋亡相关基因调控。用GFP转染肿瘤细胞凋亡相关基因,并与正常组织进行比较,则大致可判断此基因为抑制肿瘤细胞凋亡的基因;反之,为促进肿瘤细胞凋亡的基因。
肿瘤细胞浸润是肿瘤细胞粘连、酶降解、移动和基质内增殖等一系列过程的表现,其根本原因在于肿瘤细胞内某些基因表达异常。利用GFP 的示踪特性,研究肿瘤细胞内某些基因异常表达与肿瘤细胞浸润的关系,即可揭示肿瘤细胞浸润的某些机制。
1994年，华裔美国科学家钱永健（Roger Y Tsien）开始改造GFP，有多项发现。世界上用的大多数是钱永健实验室改造后的变种，有的荧光更强，有的黄色、蓝色，有的可激活、可变色。到一些不常用做研究模式的生物体内找有颜色的蛋白成为一些人的爱好，现象正如当年在嗜热生物中找到以后应用广泛的PCR用多聚酶后的一波浪潮。不过真发现的有用东西并不很多。成功的例子有俄国科学院生物有机化学研究所Sergey A. Lukyanov实验室从珊瑚里发现其他荧光蛋白，包括红色荧光蛋白。
生物发光现象，下村修和约翰森以前就有人研究。萤火虫发荧光，是由荧光酶（luciferase）作为酶催化底物分子荧光素（luciferin），有化学反应如氧化，以后产生荧光。而蛋白质本身发光，无需底物，起源是下村修和约翰森的研究。
下村修和约翰森用过几种实验动物，和本故事相关的是学名为Aequorea victoria的水母。1962年，下村修和约翰森等在《细胞和比较生理学杂志》上报道，他们分离纯化了水母中发光蛋白水母素。据说下村修用水母提取发光蛋白时，有天下班要回家了，他把产物倒进水池里，临出门前关灯后，依依不舍地回头看了一眼水池，结果见水池闪闪发光。因为水池也接受养鱼缸的水，他怀疑是鱼缸成分影响水母素，不久他就确定钙离子增强水母素发光。1963年，他们在《科学》杂志报道钙和水母素发光的关系。其后Ridgway和Ashley 提出可以用水母素来检测钙浓度，创造了检测钙的新方法。钙离子是生物体内的重要信号分子，水母素成为第一个有空间分辨能力的钙检测方法，是目前仍用的方法之一。
1955年Davenport和Nicol发现水母可以发绿光，但不知其因。在1962 年下村修和约翰森在那篇纯化水母素的文章中，有个注脚，说还发现了另一种蛋白，它在阳光下呈绿色、钨丝下呈黄色、紫外光下发强烈绿色。其后他们仔细研究了其发光特性。1974年，他们纯化到了这个蛋白，当时称绿色蛋白、以后称绿色荧光蛋白GFP。Morin和Hastings提出水母素和GFP之间可以发生能量转移。水母素在钙刺激下发光，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光。这是物理化学中知道的荧光共振能量转移(FRET)在生物中的发现。
下村修本人对GFP的应用前景不感兴趣，也没有意识到应用的重要性。他离开普林斯顿到 Woods Hole海洋研究所后，同事普腊石(Douglas Prasher)非常感兴趣发明生物示踪分子。1985年普腊石和日裔科学家Satoshi Inouye独立根据蛋白质顺序拿到了水母素的基因（准确地说是cDNA）。1992年，普腊石拿到了GFP的基因。有了cDNA，一般生物学研究者就很好应用，比用蛋白质方便多了。
普腊石1992年发表GFP的cDNA后，不做科学研究了。他申请美国国家科学基金时，评审者说没有蛋白质发光的先例，就是他找到了，也没什么价值。一气之下，他离开学术界去麻省空军国民卫队基地，给农业部动植物服务部工作。当时他如果花几美元，就可以做一个一般研究生都能做，但是非常漂亮的工作：将水母的GFP基因放到其他生物体内，比如细菌里，看到荧光，就完全证明GFP本身可以发光，无需其它底物或者辅助分子。
将GFP表达到其它生物体这项工作，1994年由两个实验室独立进行：美国哥伦比亚大学做线虫的Marty Chalfie实验室，和加州大学圣迭哥分校、Scripps海洋研究所的两位日裔科学家Inouye和Tsuji。
水母素和GFP都有重要的应用。但水母素仍是荧光酶的一种，它需要荧光素。而GFP蛋白质本身发光，在原理上有重大突破。
Chalfie的文章立即引起轰动，很多生物学研究者纷纷将GFP引入自己的系统。在一个新系统表达GFP就能在《自然》、《科学》上发表文章，其实不过是跟风性质，没有原创性。
纵观整个过程，从1961年到1974年，下村修和约翰森的研究遥遥领先，而很少人注意。如果其他生化学家愿意，他们也可以得到水母素和GFP，技术并不特别难。在1974年以后，特别是八十年代后，后继的工作，很多研究生都很容易做。其中例外是钱永健实验室发现变种出现新颜色，并非显而易见。

绿色荧光蛋白最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用。 2015年9月，科学家将一种绿色荧光蛋白注入小鸡体内，使其在实验中更容易与其他鸟类区分开来。而且每只小鸡都进行了基因改造，通过追踪一个名为“decoy”的基因，科学家可以观察它们对禽流感病毒的易感程度。
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用[1]
绿色荧光蛋的发光机理比荧光素/荧光素酶要简单得多。一种荧光素酶只能与相对应的一种荧光素合作来发光，而绿色荧光蛋白并不需要与其他物质合作，只需要用蓝光照射，就能自己发光。
在生物学研究中，科学家们常常利用这种能自己发光的荧光分子来作为生物体的标记。将这种荧光分子通过化学方法挂在其他不可见的分子上，原来不可见的部分就变得可见了。生物学家一直利用这种标记方法，把原本透明的细胞或细胞器从黑暗的显微镜视场中“纠出来”。
传统的荧光分子在发光的同时，会产生具有毒性的氧自由基，导致被观察的细胞死亡，这叫做“光毒性”，因此，在绿色荧光蛋白发现以前，科学家们只能通过荧光标记来研究死亡细胞静态结构，而绿色荧光蛋白的光毒性非常弱，非常适合用于标记活细胞。
绿色荧光蛋白
绿色荧光蛋白
然而，绿色荧光蛋白被发现20多年后，才有人将其应用在生物样品标记上。1993年，马丁·沙尔菲成功地通过基因重组的方法使得除水母以外的其他生物(如大肠杆菌等）也能产生绿色荧光蛋白，这不仅证实了绿色荧光蛋白与活体生物的相容性，还建立了利用绿色荧光蛋白研究基因表达的基该方法，而许多现代重大疾病都与基因表达的异常有关。至此，生物医学研究的一场“绿色革命”揭开了序幕。
后来，美籍华人钱永健系统地研究了绿色荧光蛋白的工作原理，并对它进行了大刀阔斧的化学改造，不但大大增强了它的发光效率，还发展出了红色、蓝色、黄色荧光蛋白，使得荧光蛋白真正成为了一个琳琅满目的工具箱，供生物学家们选用。目前生物实验室普遍使用的荧光蛋白，大部分是钱永健改造的变种。
有了这些荧光蛋白，科学家们就好像在细胞内装上了“摄像头”，得以实时监测各种病毒“为非作歹”的过程。通过沙尔菲的基因克隆思路，科学家们还培育出了荧光老鼠和荧光猪，由于沙尔菲与钱永健的突出贡献，他们与绿色荧光蛋白的发现者下村修共享了今年的诺贝尔化学奖。
瑞典皇家科学院将绿色荧光蛋白的发现和改造与显微镜的发明相提并论，成为当代生物科学研究中最重要的工具之一。

绿色萤光蛋白(green fluorescent protein),简称GFP,这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现.其基因所产生的蛋白质,在蓝色波长范围的光线激发下,会发出绿色萤光.这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助,且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用.
由水母Aequorea victoria中发现的野生型绿色萤光蛋白,395nm和475nm分别是最大和次大的激发波长,它的发射波长的峰点是在509nm,在可见光绿光的范围下是较弱的位置.由海肾(sea pansy)所得的绿色萤光蛋白,仅有在498nm有一个较高的激发峰点.
在细胞生物学与分子生物学领域中,绿色萤光蛋白基因常被用作为一个报导基因(reporter gene).一些经修饰过的型式可作为生物探针,绿色萤光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物(例如:兔子上进行表现,并拿来映证某种假设的实验方法.
GFP的性质
GFP荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强,特别在450～490nm蓝光波长下更稳定.
GFP需要在氧化状态下产生荧光,强还原剂能使GFP转变为非荧光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复.而一些弱还原剂并不影响GFP荧光.中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等.
GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析.但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白.
由于GFP荧光是生物细胞的自主功能,荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的.
GFP在肿瘤发病机制研究中的应用
GFP 是一个分子量较小的蛋白,易与其他一些目的基因形成融合蛋白且不影响自身的目的基因产物的空间构象和功能.GFP 与目的基因融合,将目的基因标记为绿色,即可定量分析目的基因的表达水平,显示其在肿瘤细胞内的表达位置和量的变化,为探讨该基因在肿瘤发生、发展中的作用及其分子机制提供便利条件.
在肿瘤的形成过程中,增殖和凋亡是一对相互矛盾的统一体.若肿瘤细胞凋亡占优势,肿瘤组织将长期处于休眠状态或自行消亡.肿瘤细胞的凋亡受凋亡相关基因调控.用GFP转染肿瘤细胞凋亡相关基因,并与正常组织进行比较,则大致可判断此基因为抑制肿瘤细胞凋亡的基因;反之,为促进肿瘤细胞凋亡的基因.
肿瘤细胞浸润是肿瘤细胞粘连、酶降解、移动和基质内增殖等一系列过程的表现,其根本原因在于肿瘤细胞内某些基因表达异常.利用GFP 的示踪特性,研究肿瘤细胞内某些基因异常表达与肿瘤细胞浸润的关系,即可揭示肿瘤细胞浸润的某些机制.
1994年,华裔美国科学家钱永健（Roger Y Tsien）开始改造GFP,有多项发现.世界上用的大多数是钱永健实验室改造后的变种,有的荧光更强,有的黄色、蓝色,有的可激活、可变色.到一些不常用做研究模式的生物体内找有颜色的蛋白成为一些人的爱好,现象正如当年在嗜热生物中找到以后应用广泛的PCR用多聚酶后的一波浪潮.不过真发现的有用东西并不很多.成功的例子有俄国科学院生物有机化学研究所Sergey A. Lukyanov实验室从珊瑚里发现其他荧光蛋白,包括红色荧光蛋白.
生物发光现象,下村修和约翰森以前就有人研究.萤火虫发荧光,是由荧光酶（luciferase）作为酶催化底物分子荧光素（luciferin）,有化学反应如氧化,以后产生荧光.而蛋白质本身发光,无需底物,起源是下村修和约翰森的研究.
下村修和约翰森用过几种实验动物,和本故事相关的是学名为Aequorea victoria的水母.1962年,下村修和约翰森等在《细胞和比较生理学杂志》上报道,他们分离纯化了水母中发光蛋白水母素.据说下村修用水母提取发光蛋白时,有天下班要回家了,他把产物倒进水池里,临出门前关灯后,依依不舍地回头看了一眼水池,结果见水池闪闪发光.因为水池也接受养鱼缸的水,他怀疑是鱼缸成分影响水母素,不久他就确定钙离子增强水母素发光.1963年,他们在《科学》杂志报道钙和水母素发光的关系.其后Ridgway和Ashley 提出可以用水母素来检测钙浓度,创造了检测钙的新方法.钙离子是生物体内的重要信号分子,水母素成为第一个有空间分辨能力的钙检测方法,是目前仍用的方法之一.
1955年Davenport和Nicol发现水母可以发绿光,但不知其因.在1962 年下村修和约翰森在那篇纯化水母素的文章中,有个注脚,说还发现了另一种蛋白,它在阳光下呈绿色、钨丝下呈黄色、紫外光下发强烈绿色.其后他们仔细研究了其发光特性.1974年,他们纯化到了这个蛋白,当时称绿色蛋白、以后称绿色荧光蛋白GFP.Morin和Hastings提出水母素和GFP之间可以发生能量转移.水母素在钙刺激下发光,其能量可转移到GFP,刺激GFP发光.这是物理化学中知道的荧光共振能量转移(FRET)在生物中的发现.
下村修本人对GFP的应用前景不感兴趣,也没有意识到应用的重要性.他离开普林斯顿到 Woods Hole海洋研究所后,同事普腊石(Douglas Prasher)非常感兴趣发明生物示踪分子.1985年普腊石和日裔科学家Satoshi Inouye独立根据蛋白质顺序拿到了水母素的基因（准确地说是cDNA）.1992年,普腊石拿到了GFP的基因.有了cDNA,一般生物学研究者就很好应用,比用蛋白质方便多了.
普腊石1992年发表GFP的cDNA后,不做科学研究了.他申请美国国家科学基金时,评审者说没有蛋白质发光的先例,就是他找到了,也没什么价值.一气之下,他离开学术界去麻省空军国民卫队基地,给农业部动植物服务部工作.当时他如果花几美元,就可以做一个一般研究生都能做,但是非常漂亮的工作：将水母的GFP基因放到其他生物体内,比如细菌里,看到荧光,就完全证明GFP本身可以发光,无需其它底物或者辅助分子.
将GFP表达到其它生物体这项工作,1994年由两个实验室独立进行：美国哥伦比亚大学做线虫的Marty Chalfie实验室,和加州大学圣迭哥分校、Scripps海洋研究所的两位日裔科学家Inouye和Tsuji.
水母素和GFP都有重要的应用.但水母素仍是荧光酶的一种,它需要荧光素.而GFP蛋白质本身发光,在原理上有重大突破.
Chalfie的文章立即引起轰动,很多生物学研究者纷纷将GFP引入自己的系统.在一个新系统表达GFP就能在《自然》、《科学》上发表文章,其实不过是跟风性质,没有原创性.
纵观整个过程,从1961年到1974年,下村修和约翰森的研究遥遥领先,而很少人注意.如果其他生化学家愿意,他们也可以得到水母素和GFP,技术并不特别难.在1974年以后,特别是八十年代后,后继的工作,很多研究生都很容易做.其中例外是钱永健实验室发现变种出现新颜色,并非显而易见.

可以构建的表达质粒的载体上，通过转染让它在细胞内表达，在汞灯的激发光下可以发出绿色荧光。一般在实验中作为参照。举个简单的例子：构建干扰细胞系是，绿色荧光蛋白的表达量可以看出干扰建系的进程。还有就是通过免疫学技术，显示蛋白表达量，一般是半定量的。

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龙里县13095149090： 绿色荧光蛋白的蛋白作用是什么? ？
冻齿赛美： 绿色荧光蛋的发光机理比荧光素/荧光素酶要简单得多.一种荧光素酶只能与相对应的一种荧光素合作来发光,而绿色荧光蛋白并不需要与其他物质合作,只需要用蓝光照射...

龙里县13095149090： 绿色荧光蛋白在生物工程中的应用 A作为标记基因,研究基因是否导入受体细胞 B诸如肌肉细胞繁殖发光小白鼠 - ？
冻齿赛美： 那个应该是显示蛋白质的踪迹的,选B吧,A是基因,C中只能标记外壳,也不能示踪DNA的路径

龙里县13095149090： 绿色荧光蛋白的介绍 - ？
冻齿赛美： 绿色荧光蛋白最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现.其基因所产生的蛋白质,在蓝色波长范围的光线激发下,会发出绿色萤光.这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助,且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用.2015年9月,科学家将一种绿色荧光蛋白注入小鸡体内,使其在实验中更容易与其他鸟类区分开来.而且每只小鸡都进行了基因改造,通过追踪一个名为“decoy”的基因,科学家可以观察它们对禽流感病毒的易感程度.

龙里县13095149090： 生物蛋白问题？
冻齿赛美： 荧光标记法(Fluorescent Labeling)是利用荧光蛋白或荧光蛋白基因作为标志物对研究对象进行标记的分析方法.常用绿色荧光蛋白为目标蛋白,通过转基因技术一起构建到载体上,可跟踪和判断生物细胞的分子变化.绿色荧光蛋白不仅在细胞生物学与分子生物学领域得到广泛的关注和应用,而且经过修饰的绿色荧光蛋白基因还可作为生物探针,对哺乳动物细胞、酵母菌细胞及细菌进行活细胞的基因定位.第一个使用荧光标记法的鲜为人知,但美国加州大学圣迭戈分校生物化学及化学系教授、美国国家科学院院士钱学森堂侄钱永健在荧光标记的发展中作出了很大的贡献.

龙里县13095149090： GFP在紫外光的照射下会发出绿色荧光.依据GFP的特性,你认为该蛋白在生物工程中的应用价值是()A. - ？
冻齿赛美： A、绿色荧光蛋白基因可作为标记基因,便于目的基因的鉴定和筛选,A错误;B、绿色荧光蛋白在紫外光的照射下会发出绿色荧光,因此能作为标签蛋白,用于研究细胞的转移,B正确;C、已经的高度分化的肌肉细胞一般不能表现出全能性,因此难以繁殖出发光小白鼠,C错误;D、噬菌体的外壳是由蛋白质组成的,因此用绿色荧光蛋白标记噬菌体只能示踪蛋白质的转移途经,D错误. 故选:B.

龙里县13095149090： 求“荧光蛋白在生命科学研究中的应用”论文材料~! - ？
冻齿赛美： 1、绿色荧光在建立基因转化技术及在研究基因表达方面的应用,绿色荧光在各种异源细胞中表达后均可检测到荧光的发射,且对寄主细胞不存在毒性.2、GFP在基因产物及基因定位研究中的应用,GFP在接上各种细胞内定位序列(localization...

龙里县13095149090： 绿色荧光蛋白(GFP)能在蓝光或紫外光的激发下发出荧光,这样借助GFP发出的荧光就可以跟踪蛋白质在细胞内部的移动情况,帮助推断蛋白质的功能.下... - ？
冻齿赛美：[答案] (1)①限制性核酸内切酶Ⅰ的识别序列和切点是-G↓GATCC-,则图2中被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端为:、. ②酶Ⅰ和... (基因)→基因表达合成相应的蛋白质.因此采用蛋白质工程技术制造出蓝色荧光蛋白过程的正确顺序是:②①③④. 故答案为...

龙里县13095149090： 为什么用荧光蛋白对细胞膜进行标记,一般标记在蛋白质上 - ？
冻齿赛美： 荧光蛋白 第一批用于细胞生物学的荧光蛋白包括藻胆蛋白(phycobiliproteins)和从蓝藻(cyanobacteria)中提取的触角光合色素(photosynthetic antenna pigments).这些生物大分子都含有多种胆汁三烯生色基团(bilin chromophores).这...