荧光素酶报告基因的应用原理

荧光素酶报告基因的应用原理~

转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase
assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。
其原理简述如下：
（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。
（2）
将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。
（3）
加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

（1） 用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。（2）设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒（pGL3-basic）中。（3）筛选阳性克隆，测序。扩增克隆并提纯质粒备用。（4） 扩增转录因子质粒，提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照，提纯备用。（5） 培养293（或其它目的细胞），并接种于24孔板中，生长10-24小时（80%汇合度）。（6） 将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。（7）提取蛋白并用于荧光素酶检测。（8） 加入底物，测定荧光素酶的活性。（9） 计算相对荧光强度，并与空载对照比较。

应用原理

转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。

荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。

其原理简述如下：

（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。

（2） 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。

（3） 加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

扩展资料

应用

植物基因工程

在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因有以下几种：胭脂碱合成酶基因（nos）、章鱼碱合成酶基因（ocs）、新霉素磷酸转移酶基因（nptⅡ）、氯霉素乙酰转移酶基因（cat）、庆大霉素转移酶基因、葡萄糖苷酶基因、荧光酶基因等。

nos、ocs这两个基因是致瘤土壤农杆菌（Agrobacterium tumfaciens）的Ti质粒特有的，对Ti质粒进行改造，用相应的致瘤农杆菌转化植物体时，如果外源基因转入植物体中，则这两种报告基因在植物根茎叶中均能表达，不受发育调控，检测时直接用转化体提取液进行纸电泳，染色后在紫外光下观察荧光即可。

nptⅡ、cat及庆大霉素转移酶基因，均为抗生素筛选基因，相关的酶可以对底物进行修饰（磷酸化、乙酰化等），从而使这些抗生素失去对植物生长的抑制作用，使得含有这些抗性基因的转化体能在含这些抗生素的筛选培养基上正常生长，也可以用转化体提取液体，外用同位素标记，放射自显影筛选转化体。

常用的一种报告基因是β-D-葡萄糖苷酶基因，该酶催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱、荧光等进行检测。

荧光酶基因（luc）是1985年从北美荧火虫和叩头虫cDNA文库中克隆出来的，该酶在有ATP、Mg2+、O2和荧光素存在下发出荧光，这样就可用转基因植物整株或部分直接用X-光片或专门仪器进行检测。

动物基因工程

在动物基因表达调控的研究中，报告基因也被广泛应用。常用的有氯霉素乙酰转移酶基因（cat）、β-半乳糖苷酶基因（LacZ）、二氢叶酸还原酶基因、荧光酶基因等。

cat基因作为报告基因，检测时可通过放射自显影观察。荧光酶基因作为报告基因，具有检测速度快、灵敏度比cat基因高30～1000倍、费用低、不需使用放射性同位素等优点，得到了广泛的采用。

检测因子作用

可通过报告基因的表达，研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用。双杂交体系是由报告基因转录调控区、报告基因及一对可以相互作用的杂合反式作用因子组成。

来从上述杂交体系中发展出的单一杂交体系技术，也是根据报告基因表达量的检测筛选出与已知顺式作用元件相结合的未知因子的DNA，该项技术正广泛应用于克隆细胞中含量微弱且用生化手段难以纯化的反式作用因子。

由此可知，报告基因在基因表达调控和基因工程研究中处于非常重要的地位，它是作为外源目的基因能否转化植物体的探路先锋而首先被研究的，在研究植物的基因表达调控方面起着重要的作用，现已推广到真核生物的基因调控领域中。随着基因工程技术日新月异的发展，报告基因这一探路者的作用会更明显。

参考资料来源：百度百科-荧光素酶报告基因

参考资料来源：百度百科-报告基因

转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。
其原理简述如下：
（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。
（2） 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。
（3） 加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

荧光素酶报告基因是指以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。
普洛麦格(北京)生物技术有限公司在为生命科学领域提供创新性解决方案和技术支持方面处于全球领先地位。公司生产的2,000多种产品使全球科学工作者们能加快对细胞分析、蛋白组学和基因组学研究的认知，以及在药物筛选、分子诊断和遗传鉴定领域的应用。

---

登封市18696276481： 荧光素酶互补技术原理 ？
尘庆生脉： 荧光素酶互补技术能验证转录因子互作转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子,也称为反式作用因子.某些转录因子仅与其靶启动子中的特异...

登封市18696276481： 哪位同学可以介绍下Luciferase 原理 - ？
尘庆生脉： 自然界中广泛分布着生物发光有机体,其中包括细菌、真菌、鱼、昆虫等.在这些生物发光有机体中催化生物发光反应的各种酶都称之为荧光素酶(Luciferases),底物则命名为荧光素(Luciferin).自1986— 1987 年首次被当作报告基因使用...

登封市18696276481： 荧光素酶报告基因的结果在什么范围算是阳性 - ？
尘庆生脉： 荧光素酶报告基因的结果在什么范围算是阳性 转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子,也称为反式作用因子.某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合,这些特异性的序列被称为顺式作用元件,转录因子的...

登封市18696276481： 荧光素酶报告基因的简介 - ？
尘庆生脉： Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统.荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin,在luciferin氧化的过程中,会发出生物荧光(bioluminescence).然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光.荧光素和荧光素酶这一生物发光体系,可以极其灵敏、高效地检测基因的表达.是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法.

登封市18696276481： 设计一个检测某一基因是否转录的检测方法的实验,简述其过程与原理. - ？
尘庆生脉： 原理:转录是以一条DNA链为模板,合成出一条mRNA的过程.所以,检测某一基因在特定条件下是否转录,可以提取样品的mRNA,反转录成cDNA,然后用扩增该基因的PCR引物扩增,如果有条带就是说明转录,没有条带就是不转录. 过程: 1.提取样品mRNA; 2.反转录合成cDNA; 3.设计该基因特异的PCR引物; 4.进行PCR扩增,电泳,检测结果.

登封市18696276481： 荧光素酶的应用 - ？
尘庆生脉： 萤光素酶可以在实验室中用基因工程的方法生成,并被用于多种不同的实验.萤光素酶的基因可以被合成并插入到生物体中或转染到细胞中.研究者利用基因工程已经使得小鼠、家蚕、马铃薯等一些生物可以合成萤光素酶.间接体外成像是一种...

登封市18696276481： 报告基因的列举 - ？
尘庆生脉： (1)最常用的报告基因大多是编码抗生素抗性蛋白的基因,通过检查产物是否具有抗生素的抗性来确定基因的表达情况. (2)氯霉素乙酰基转移酶(CAT):该报告基因来源于大肠杆菌转位子9,是第1个用于检测细胞内转录活性的报告基因.氯霉素...

登封市18696276481： 荧光素酶报告基因的介绍 - ？
尘庆生脉： Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统.

登封市18696276481： 基因片段的hr区是什么意思 - ？
尘庆生脉： Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统.荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin,在luciferin氧化的过程中,会发出生物荧光(bioluminescence).然后可以通...

登封市18696276481： 荧光素酶报告基因实验中能干扰转录因子吗 - ？
尘庆生脉： (1) 用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点.(2)设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段,将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒(pGL3-basic)中.(3)筛选阳性克隆,测序.扩增克隆并提纯质粒备用.