慢病毒转染细胞,如何测moi值
你好，慢病毒转染细胞的操作步骤如下：
1、慢病毒转染前18-24小时，将贴壁细胞以1×10^5/孔铺到24孔板中。使细胞在慢病毒转染时的数量为2×10^5/孔左右。
2、第二天，用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液。37℃孵育。
3、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后加入2ml新鲜培养基以稀释polybrene。
4、继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。
5、继续培养。如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染48小时后可见明显荧光表达，72小时后更加明显。如需FACS检测转染效率，可在转染后72-96小时进行。如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选，可以在转染3-4天后开始加药。
二、慢病毒转染悬浮细胞实验方法
1、在2×10^5/ml悬浮细胞中加入polybrene至6 μg/ml和适量病毒，充分混匀。37℃孵育。或者150g室温离心4小时(选作，部分难转染的细胞系采用此步骤可以提高转染效率)。
2、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后(或离心结束后)加入等体积新鲜培养基以稀释polybrene。
3、继续培养3-4天。中间视细胞生长情况可传代或换液。
细胞系预实验-MOI 的确定
预实验的目的是了解所操作细胞被慢病毒载体感染的容易程度，另一方面在一些情况下虽然慢病毒已经感染进入细胞，但由于表达标记基因的启动子在该细胞内的表达效率不高，没能观察到感染现象。我们在预实验方案中加入不同启动子的病毒进行感染，并且用定量PCR测定感染后细胞内整合病毒，这样即使病毒没有表达也可以观察感染。
感染前一天接种，使得第二天细胞汇合度为30-40%。培养板可以是96孔板（只通过显微镜观察荧光）或是24孔板（通过流式或是定量PCR确定感染比例）。
2. 设置不同MOI值的感染组，通常设立1，2，5，10，20，50，100的感染组别，各做两个孔，一个孔中加入终浓度为5 μg/ml的polybrene，另一组不加。Polybrene可以促进病毒对细胞的侵染，但在少数情况下它对细胞有伤害。常用的对照病毒包括CMV-GFP，EF1a-GFP，UbiC-GFP，PGK-GFP。一般细胞里面CMV启动子的表达活性是最强的，但在血液来源的一些癌细胞中EF1a的表现要优于CMV。UbiC在一般细胞中都表达，但表达活性一般要低一些，它在神经元等原代细胞的感染中是最好的。
3. 12-24小时后，将培养上清丢掉同时除去没有感染细胞的病毒，更换为新鲜的培养基。
4. 感染3-4天后可以在荧光显微镜下观察，细胞应当会被感染并表达荧光。细胞感染的比例可以通过拍照目测估计或是根据图片数数计算。
5. 如果是用24孔板做的预实验，则可以用消化液将细胞消化成单个，通过流式细胞法得到每个感染复数下被感染细胞比例，此时注意设置空细胞组用于对照。
6. 也可以将消化下来的细胞抽提基因组DNA，用滴度测定中介绍的定量PCR方法得到整合病毒和细胞的比例。注意如果是所感染为动物细胞则需要用相应物种的内参基因。
当后期实验用的细胞培养面积与预实验不同时，则需要放大感染系统。实验体系放大的原则是保持细胞的密度一致，按照底面积增加病毒用量，同时保持培养基和底面积的比例就可以达到与预实验一致的感染效果。当细胞密度与预实验有出入时，如果细胞密度变大，则相应增加病毒用量，如果细胞密度变小，则保持病毒用量不变。
预实验的目的是了解所操作细胞被慢病毒载体感染的容易程度，另一方面在一些情况下虽然慢病毒已经感染进入细胞，但由于表达标记基因的启动子在该细胞内的表达效率不高，没能观察到感染现象。我们在预实验方案中加入不同启动子的病毒进行感染，并且用定量PCR测定感染后细胞内整合病毒，这样即使病毒没有表达也可以观察感染。
1. 感染前一天接种，使得第二天细胞汇合度为30-40%。培养板可以是96孔板（只通过显微镜观察荧光）或是24孔板（通过流式或是定量PCR确定感染比例）。
2. 设置不同MOI值的感染组，通常设立1，2，5，10，20，50，100的感染组别，各做两个孔，一个孔中加入终浓度为5 μg/ml的polybrene，另一组不加。Polybrene可以促进病毒对细胞的侵染，但在少数情况下它对细胞有伤害。常用的对照病毒包括CMV-GFP，EF1a-GFP，UbiC-GFP，PGK-GFP。一般细胞里面CMV启动子的表达活性是最强的，但在血液来源的一些癌细胞中EF1a的表现要优于CMV。UbiC在一般细胞中都表达，但表达活性一般要低一些，它在神经元等原代细胞的感染中是最好的。
3. 12-24小时后，将培养上清丢掉同时除去没有感染细胞的病毒，更换为新鲜的培养基。
4. 感染3-4天后可以在荧光显微镜下观察，细胞应当会被感染并表达荧光。细胞感染的比例可以通过拍照目测估计或是根据图片数数计算。
5. 如果是用24孔板做的预实验，则可以用消化液将细胞消化成单个，通过流式细胞法得到每个感染复数下被感染细胞比例，此时注意设置空细胞组用于对照。
6. 也可以将消化下来的细胞抽提基因组DNA，用滴度测定中介绍的定量PCR方法得到整合病毒和细胞的比例。注意如果是所感染为动物细胞则需要用相应物种的内参基因。
当后期实验用的细胞培养面积与预实验不同时，则需要放大感染系统。实验体系放大的原则是保持细胞的密度一致，按照底面积增加病毒用量，同时保持培养基和底面积的比例就可以达到与预实验一致的感染效果。当细胞密度与预实验有出入时，如果细胞密度变大，则相应增加病毒用量，如果细胞密度变小，则保持病毒用量不变。
慢病毒转染细胞细胞长得太快怎么处理
慢病毒传染细胞，细胞长得太快怎么处理”？1、首先，将培养基中的营养物质浓度降低，降低血清浓度、减少氨基酸、维生素的添加量，减缓细胞的生长速率。2、其次，向培养基中添加合适浓度的抑制剂，抑制细胞的增殖。3、最后，在培养过程中定期采用稀释法对细胞进行稀释，降低细胞密度，延缓细胞生长速率。
病毒转染时,细胞是静态还是动态的好
动态好。静态状态下，细胞的表达模式更为稳定，从而帮助病毒与宿主细胞之间的互作，动态状态下的细胞具有更高的代谢活性和更强的生长潜力，在感染后可迅速响应外部刺激，并对病毒的干扰作出回应，所以病毒转染时，细胞呈动态要好一些。
慢病毒转染细胞,如何测moi值
1. 感染前一天接种，使得第二天细胞汇合度为30-40%。培养板可以是96孔板（只通过显微镜观察荧光）或是24孔板（通过流式或是定量PCR确定感染比例）。2. 设置不同MOI值的感染组，通常设立1，2，5，10，20，50，100的感染组别，各做两个孔，一个孔中加入终浓度为5 μg\/ml的polybrene，另一组不...
转染是什么意思
1、瞬时转染 一种利用外源DNA或RNA进行基因表达的实验技术。质粒是一种小型环状DNA分子，可以存在于许多细菌和酵母等宿主细胞中。通过将外源DNA或RNA与质粒结合，可以将它们导入到宿主细胞中。为了提高转染效率，通常使用超螺旋质粒DNA，这是一种紧密的质粒形态，可以更好地进入宿主细胞。在转染后24-72小时...
慢病毒细胞转染是什么意思
慢病毒细胞转染是指利用慢病毒作为载体，将某种外源基因和重组质粒等DNA分子导入到目标细胞中的一种技术手段。慢病毒可以带有细胞进入人体细胞内，随后融入宿主细胞的DNA中。此种技术应用广泛，可以用于基因治疗、基因表达等研究中。慢病毒细胞转染适用于大多数哺乳动物细胞，包括人类细胞，其效率较高，转染后...
转染病毒的细胞为什么全是小黑点
因为病毒要侵染细胞需要先破坏细胞膜结构（就是内吞啥的），很多细胞就裂解了，内容物从细胞内释放出来，就会形成很多小黑点，其实是细胞碎片。换几次液就好了。要是越来越多，那就是被污染了。
悬浮细胞病毒转染铺6孔板要多少细胞
1. 在进行悬浮细胞病毒转染前18至24小时，应确保贴壁细胞以每孔1×10^5的数量接种到24孔板中，以便在慢病毒转染时细胞数量达到大约2×10^5\/孔。2. 转染第二天，用含有6 μg\/ml polybrene的2ml新鲜培养基替换原有的培养基，并加入适量的病毒悬液。之后将细胞在37℃下孵育。3. 对于对polybrene敏感...
慢病毒转染进细胞后细胞会漂浮起来吗
不会的。要是你转染的病毒的moi太高，细胞状态会不好，会漂浮起来，死掉。。。
转染是什么意思
细胞转染实验原理：外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法、脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法...
细胞转染目的,转染成功证明什么?有什么意义
细胞转染是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。细胞转染技术有助于研究和控制真核细胞基因功能。在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中，其应用越来越广泛。随着基因与...
泊何丙氨： MOI :multiplicity of infection,感染复数.传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究.其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值,也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量.噬菌体的数量单位为pfu.一般认为MOI是一个比值,没有单位,其实其...
台山市15972623283： 慢病毒转染原代细胞是稳定转染吗 - ？
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台山市15972623283： 如何建耐药细胞株? - ？
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泊何丙氨： Multiplicity of infection (MOI)The multiplicity of infection (abbreviated MOI) is the average number of phage per bacterium. The MOI is determined by simply dividing the number of phage added (ml added x PFU/ml) by the number of bacteria added ...
台山市15972623283： 判断THP - 1细胞体外培养时健康的标准或主要特点? - ？
泊何丙氨： 通常通过提高MOI值来提高病毒的转染效率,必要时可以在培养基中加入polybrene(5-10 μg/ml)来提高病毒的感染效率.同时,目的细胞良好的生长状态是获得正常感染效率的保证.
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泊何丙氨： 你好,慢病毒转染细胞的操作步骤如下: 1、慢病毒转染前18-24小时,将贴壁细胞以1*10^5/孔铺到24孔板中.使细胞在慢病毒转染时的数量为2*10^5/孔左右. 2、第二天,用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鲜培养基替换原培养基,加入适量病...
台山市15972623283： 慢病毒转染进细胞后细胞会漂浮起来吗?为什么慢病毒转染进细胞24小时后要收集上清离心阿~?还有如何 - ？
泊何丙氨： 慢病毒转染进细胞后细胞会漂浮起来吗? 不会,除非你转染太多,细胞死了.为什么慢病毒转染进细胞24小时后要收集上清离心阿~? 因为慢病毒可以被细胞分泌出胞外,大量存在于血清中.收集上清多方便啊~还有如何流式测滴度?流式细胞仪的原理就是将细胞分群,将感染和非感染的细胞分群.具体操作最好问专业的操作人员,因为每台机子都不一样……
台山市15972623283： 细胞稳定转染的问题 - ？
泊何丙氨： 使细胞由荧光显色并且增殖后也有荧光,这个得是稳转株.最好的方法是转染表达荧光蛋白的慢病毒,当然前提是你的细胞可以转染慢病毒.你可以自己做,也可以去公司买,不贵.不能转染慢病毒,或者说慢病毒转染效率低的,可以用脂质体转染,把荧光蛋白构建在真核表达载体(重组)上,转染细胞.上述两种方法转染后,用流式细胞仪等方法筛选稳转株,就可以了.
台山市15972623283： 回转窑安装步骤、方法和要求是什么求大神帮助 - ？
泊何丙氨： 回转窑的安装步骤如下: 一、底座安装: 1.将底座安装在基础墩上; (1)将底座上划出纵横向中心线; (2)底座的放置位置:其纵横向中性线应与中心标板重合. 2.用斜度规找正倾斜度. 二、托轮组的安装:将零部件清洗干净,按照配合字...
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