搞懂illumina nextera Tn5 和ATAC seq adaptor 序列
在准备NGS文库的时候，会有用到转座酶Tn5， Nextera DNA Library Preparation Kit ，比如ATAC-seq就有用到这个Tn5。转座酶携带有特定的序列称为 转座子Transposon 。
下面是ATAC-seq的工作原理，想必听说过ATAC-seq的，对这个图都会再熟悉不过了。
Tn5是kit里面带有的，没什么大不同。ATAC-seq 的barcoded primers （adaptors）会有一些不同，接下来，看下图中的每段序列对应的sequnce都是什么。
下面图例，Nextera tn5用来给基因组DNA加adaptors。
下面的图片就是准备ATAC-seq时候需要用到的index primer （adaptor），和Nextera DNA library prep kit里的有一点类似，但是也很不同。Ad1_noMX是Forward 引物，没有index （barcode），所以只有一个。Reversed引物有24个Ad2.（1-24），所以有24组不同的index （barcode）序列。这个index序列是和Nextera一样的。我涂红色部分就是index序列的反向反义序列，每个index序列是不同的8个碱基，这个和Nextera的i7（部分一样，请自己对照）是一样的。
i5 sequence: ATAC-seq的Adaptor1 里没有barcode
i7 sequence:
有两种Adaptors，分别为Adaptor1 （50bp） 和Adaptor2 （53bp）。
其中Adaptor1（5’ illumina Primer1 sequence （29bp）+ Tn5 Read1 sequence（14bp）（再延伸到ME里面7bp）3’），Adaptor2（5’ illumina Primer2 sequence（24bp）+ barcode sequence （8bp）+ Tn5 Read2 sequence （15bp）（再延伸到ME里面6bp）3’）
这样算来，ATAC-seq library的长度=左面（Adaptor1 长度 +剩余部分Tn5的ME（12 bp_TATAAGAGACAG））+ open chromatin 的DNA长度+右面（剩余部分Tn5的ME（13bp_GTATAAGAGACAG）+ Adaptor2 长度）=open chromatin 的DNA长度 + 128bp。
所以，在ATAC-seq的libraries中 mono nucleosome的ATAC-seq library长度大概是(单核小体146bp+核小体free region)+两端的adaptor及Tn5最里面部分ME序列长度（50bp+12bp+13bp+53bp）=274bp+free region，也就是bioanalyzer里面看到的第二个peak。图中显示大概是340bp左右。所以free region应该是330bp-274bp=56bp 。
那么会问，对不对呢？看下bioanalyzer的第一个peak，显示是182bp，这个peak代表的是nucleosome free region的ATAC-seq library，所以是nucleosome free region序列长度 + 两端的adaptor及Tn5部分ME序列长度（50bp+12bp+13bp+53bp）=182， 所以，不难得出同样的结果，nucleosome free region序列长度是54bp。差不多哦
以此类推，第三个peak代表de-nucleosome ， 500bp到550 bp之间，是不是等于两个核小体长度加上核小体空隙序列再加上两个adaptor， 2 146bp + 2 55bp + 128bp= 530bp （为什么55bp也要乘2？答：多出来一个核小体当然就多出来一份核小体空隙）
nucleosome free region, mono-nucleosome, de-nucleosome and try-nucleosome
“GAP不是服装品牌，而是个坑”。
所以需要在PCR第一步，需要5min的72摄氏度来填坑。
还要注意，就是在tagmentation的时候会出现三种产物，上面的图只是其中一种。
哪里说的不对欢迎纠正，请留言。
参考：
http://ecoliwiki.net/colipedia/index.php/Transposon_Tn5
http://nextgen.mgh.harvard.edu/attachments/Nextera%20Protocol.pdf
https://teichlab.github.io/scg_lib_structs/SMART-seq_family.html
http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/ez-tn5-transposase.pdf?sfvrsn=4
搞懂illumina nextera Tn5 和ATAC seq adaptor 序列
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