PT-PCR时如果cDNA量少怎么办
因为你所要检测的目的片段丰度不同，所以需要先做个预实验。
怎么做呢？
你先把cdna进行梯度稀释，然后进行pcr，如果你的primer所扩增的ct值在15-25之间，那么就是很不错的稀释梯度啦～
以后实验久按照这个浓度加就好了
这个没有明确的规定，一般用的最多的是1-100ng/ul（工作浓度）。浓度太低和太好都会影响扩增效率，但并不是绝对的。因为有一些基因表达水平极低，有一些在特殊情况下又极高。qPCR很多时候仅仅反映的是几个样品之间的趋势，而不是绝对值。
一般这种情况是你用你扩增后的样品做模板在进行扩增就行，还有ptpcr一般30个循环内才行可以增加循环数
pcr反应体系包括哪几个组分
设计PCR引物时的一般原则：(1)引物长度一般15~ 30碱基，过短则特异性低; 过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增。(2) 避免内部二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。(3) G\/C 和A\/T 碱基均匀分布，G\/C 含量在45%~ 55% 之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机...
影响PCR反应效率的因素有哪些?如何有效地提高PCR反应的效率?
也可根据引物的(G+C)%含量进行推测,把握试验的起始点,一般试验中退火温度Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解温度TTm(melting temperature)低5℃,可按公式进行计算: Ta = Tm - 5℃= 4(G+C)+ 2(A+T) -5℃ 其中A,T,G,C分别表示相应碱基的个数。例如,20个碱基的引物,如果(G+C)%含量为50%时...
简述PCR技术的基本原理及反应条件的选择
Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T) 复性温度=Tm值-(5～10℃) 在值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合, 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为～,足以使引物与模板之间完全结合。 ③延伸温度与时间:Taq DNA聚合酶的生物学活性: 70～80℃ 150核苷酸\/S\/酶分子 70℃ 60核...
在生物实验中PCR的具体步骤是什么?
（五）设计PCR反应的注意事项 (1)双链DNA的变性温度是由双链中C+G的含量决定的，C+G含量越高，模板DNA的溶解温度就越高。在选择的变性温度下，模板链越长变性所需时间就越长。如果变性温度过低或变性时间过短，会使仅仅富含A+T区域变性。当模板DNA的G+C含量超过55%的时需要更高的变性温度。 (...
RT-PCR实验操作的注意事项
尽管如此,为达到最佳效果,建议保存在2-8°C的环境下。2.RT-PCRRT-PCR是指将逆转录(Reverse Transcription;RT)反应和PCR (Polymerase Chain Reaction)反应...为了在逆转录反应中最大限度提高RT-PCR的灵敏度,可以加入10%的甘油并在45℃保温。如果1\/10的逆转录反应产物加入到PCR中,那甘油在扩增反应中的浓度为0.4...
在PCR扩增实验中应注意什么?
5. 温度循环参数中应特别注意复性温度，它决定引物与模板的特异性结合。退火复性温度可根据引物的长度，通过Tm＝4(G+C)+2(A+T) 计算得到。在Tm允许的范围内，选择较高的退火温度可大大减少引物与模板之间的非特异结合。6. 减低污染的常规措施：①将PCR试剂、PCR产物及其他分子生物学试剂分开放置；...
各位高手谁能给我详细的讲解一下PCR技术的过程
对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度: Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T) 复性温度=Tm值-(5～10℃) 在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合, 提高PCR反应的特异性。复性时间...
实时荧光定量PCR中两种引物的设计有什么要求
4.G+C含量在40%~60%之间，45-55％最佳。5.碱基要随机分布，尽量均匀。6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。8.引物5′端可以修饰。9. 3’端不要以A结尾，3′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T\/C,A\/G连续结构（2-3个）。10. 引物3′...
如何设定PCR引物的保护碱基?如何对PCR扩增的产物进行酶切?
引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则:(1)引物长度约为16-30bp,太短会降低退火温度影响引物与模板配对,从而使非特异性增高。太长则比较浪费,且难以合成。(2)引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度Tm=4(G+C)+2(A+T).(3)四种碱基应随机...
怎么设计realtime pcr引物
1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区5’端的300-400bp区域内，可以用DNAman, Alignment 软件看看结果。2.引物长度一般在17-25碱基之间，上下游引物不能相差太大。3.G+C含量在40%~60%之间，45-55％最佳。4.引物序列要求：A、T、C、G整体分布尽量均匀，不能有部分AT ...
泷瞿樟脑：[答案] 一般这种情况是你用你扩增后的样品做模板在进行扩增就行,还有ptpcr一般30个循环内才行
龙华区14757573601： PT - PCR时如果cDNA量少怎么办 - ？
泷瞿樟脑： 一般这种情况是你用你扩增后的样品做模板在进行扩增就行,还有ptpcr一般30个循环内才行
龙华区14757573601： 荧光PCR的cDNA的量不同会影响结果吗 - ？
泷瞿樟脑： 相同样品相同基因cDNA的量不同,得到的Cq值就不同.基因的表达量少,Cq值就会偏大.如果这个基因的表达量很小且加入的cDNA量又不足的话就可能由于反应循环数过多导致反应体系中的酶活性下降,从而使得结果不稳定和可重复性差.所以想要得到一个可信的结果就需要使得得到的Cq值在一定的范围之内,不能太大也不能太小.
龙华区14757573601： q - pcr,关于cDNA加的多少量的问题 - ？
泷瞿樟脑： 这个没有明确的规定,一般用的最多的是1-100ng/ul(工作浓度).浓度太低和太好都会影响扩增效率,但并不是绝对的.因为有一些基因表达水平极低,有一些在特殊情况下又极高.qPCR很多时候仅仅反映的是几个样品之间的趋势,而不是绝对值.
龙华区14757573601： PT - PCR操作流程 - ？
泷瞿樟脑： 是RT-PCR啊. 一、实验器具与材料: 1、移液枪:1ml、200μl、20μl、10μl、2μl 2、吸头:1ml、200μl、20μl 3、匀浆管:5ml 4、吸头台:放置1ml吸头的一个,放置20μl吸头的一个 5、EP管:1.5ml、0.2ml、100μl 6、试剂瓶:2个60ml的棕色...
龙华区14757573601： 我做的RT - PCR,提取的是动物细胞,DNA电泳有痕迹却没有条带,可能的原因有哪些啊? - ？
泷瞿樟脑： 建议建立内参,其次很可能是模板量过低,增加模板量试试吧. 你的痕迹是指你跑出来的条带淡,还是根本就没有跑出来,那些条与你的mark对到上吗.如果对不上可能就是不是你的条带.
龙华区14757573601： 需要做PT - PCR的组织收集时需要注意什么 - ？
泷瞿樟脑： 最好用新鲜的组织,如果不能立即使用就用液氮迅速冷冻,组织在冷冻前最好切成小块分开保藏,避免反复冻熔,一个PT-PCR反应不需要多少RNA,因此不要搞好大一块组织,只要黄豆大小一块足够了,一般组织块加入TRIZOL中,内部还是很难被浸润的,所以组织块的内部RNA很容易降解,最好就是组织加入TRIZOL后立即匀浆,匀浆的好坏直接决定最后RNA的质量,最好用专业的匀浆设备,并且要注意匀浆的时间,防止样品过热,其它的就跟细胞的RNA提取差不多了
龙华区14757573601： 如何检测cDNA的纯度,有什么方法 - ？
泷瞿樟脑： cDNA量少,直接跑看不出来什么,即使有弥散也不能说明质量好坏.纯度的话用跨内含子的housekeeping基因引物P,看产物大小,避免有基因组残余.有符合要求的目的基因的引物更好了,但是表达量少的话容易P不出来 反转要成功,首先RNA要好,操作要小心,RNasin要加,dNTP要新的(至少也是RT专用的).热变性要充分
龙华区14757573601： 反转录时,是不是RNA越多越好? - ？
泷瞿樟脑： 博凌科为-为你解答:在RT-PCR说明书上一般会表明使用的RNA量的范围,在这范围内模板量越多,得到的cDNA量越多,如果取1ul做模板,差别不大,你可以尝试将cDNA进行稀释,在用看家基因的引物进行PCR,这样就可以通过电泳条带的明暗来判断之前使用的RNA的模板量.希望对你有帮助!
龙华区14757573601： RT - PCR1. cDNA产量低怎样解决? - ？
泷瞿樟脑： RNA模板质量低 对mRNA浓度估计过高 反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足 同位素磷32过期 反应体积过大,不应超过50μl2. 扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅*最常见的原因在于您的反应体系是PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系 与反应起始时RNA的总量及纯度有关 生物帮上面看看,底座/架(自动化) http://product.bio1000.com/101206/
