t载体连接大片段
载体与片段的摩尔比例如何计算
载体与片段的摩尔比例计算：先算出载体和目的基因的浓度，（可以跟mark的亮度对比估算，也能用软件计算），再根据摩尔质量比和基因的大小算出质量比，再算出体积比就行。载体与插入片段比例一般是1:10，通过测定DNA浓度来调整。单酶切片段插入时，载体一定要去磷酸化，载体易自连；双酶切二者比例要适当...
基因编辑-载体构建-同源重组之Gibson法
DNA二级结构影响以及引物设计的特异性。它与CRISPR技术结合，能处理复杂克隆任务，如大载体或染色体片段的克隆，避免了PCR难题。除了Gibson，还有SLIC和CPEC等基于同源重组的克隆方法，以及Golden gate和Gateway等各有特点的载体克隆方式。在选择克隆方法时，应根据具体实验需求考虑Gibson连接等替代技术的优势。
载体与目的片段连接问题
不要大抽的质粒 小抽的质粒就可以做了 连接的时候要保证插入片段是载体量的10倍 载体一般0.1ug就够了
连接体系中,载体与外源基因的比例关系是固定不变的吗,什么时候可以颠倒...
LZ您好 不是固定不变的,但比例颠倒会影响合成效率!理论上载体和片段应该是1:1的关系,然而化学反应本身是分子间的反应,载体质量大于片段,混合均匀时,假设二者分子拥有一致的动能,显然根据E=mv²\/2,质量更小的片段拥有更高(同时复杂)的运动!所以分子碰撞的原因,更依赖于速度更大,布朗运动更复杂的...
重组质粒反应策略
重组质粒反应策略主要涉及三种不同的外源DNA片段与质粒载体的连接方式：1. 非互补突出端连接：通过两种不同限制酶切割产生非互补粘性末端，这是最易克隆的DNA片段。大多数质粒载体拥有多个不同酶的识别序列，使得几乎总能找到与外源片段末端相匹配的酶切位点，从而定向地将片段插入载体。PCR扩增时，可以在...
载体和目的片段连接
这个需要一定的经验。例如一般的1KB ladder，最亮的条带在点样3微升时为50ng，那么你看你的条带的亮度大约是ladder条带亮度的10倍的话，你就知道你点的样大约是500ng了。比例的话尽量保持在10：1~3：1间，太少会降低连接效率，拿不到克隆，太高浪费，也会造成非预料的连接结果。明白了么？
酵母人工染色体的YAC 载体的工作原理
这些元件在酵母菌中可以驱动染色体的复制和分配，从而决定这个微型染色体可以携带酵母染色体大小的 DNA 片段。图3-27描绘了 YAC 载体的原理性工作流程。对于BamHⅠ切割后形成的微型酵母染色体，当用EcoRⅠ或SmaⅠ切割抑制基因 sup4 内部的位点后形成染色体的两条臂，与外源大片段 DNA 在该切点相连就形成一...
柯斯质粒载体三.柯斯克隆
柯斯质粒载体技术，以其独特的方式在大肠杆菌细胞中实现了真核基因组DNA的大片段克隆，这一过程被称为“柯斯克隆”（cosmid cloning）。其核心原理基于λ噬菌体DNA的特殊结构。λ噬菌体的DNA两端拥有互补的单链突出序列，即粘性末端（cos位点），这些位点使得DNA分子能够以特定方式连接，形成多连体分子。λ...
请问我在构建载体时候,制备目的片段时候,PCR的时候加入目的质粒量有没...
PCR 那需要这么多质粒模板？几ng就行了。片段连接也不需要这么多的量，100-200ng足够了，1ug片段是个很大的量
在做克隆时,载体与目的片段的比例怎样确定?比例不对,是造成假阳性的主要...
载体与插入片段比例一般是1:10，通过测定DNA浓度来调整。单酶切片段插入时，载体一定要去磷酸化，载体易自连；双酶切二者比例要适当，比例不对，载体也会自连，因为微生物有自己的修护系统。
泸溪县节宗回答： 中科院一般都是用TAKARA的T载体.有的国产产品说,效率提高,但不太敢用国产的东西.
衷肃15260027688问： 载体构建若目的片段大于3kb,连接时有没什么比较有效率的方法? - ？
泸溪县节宗回答： 如果目的片段过长不好连接,可考虑T载体,连接效率还是比较高的
衷肃15260027688问： T载体是什么? - ？
泸溪县节宗回答： 一段线性双链DNA载体,载体的两端3'末端各有一个额外的T.因为大部分Taq聚合酶会在PCR产物3'末端添加一个额外的A,所以使用T载体可以比较方便且高效(相对于平末端)进行PCR产物的连接反应,以方便克隆的构建或检测.
衷肃15260027688问： 片段连接t载体后可以直接pcr吗 - ？
泸溪县节宗回答： 我记得好像应该转化后,用菌斑或者菌液pcr
衷肃15260027688问： ta克隆的优缺点 - ？
泸溪县节宗回答： 一、缺点: 1、PCR产物的酶切和判断比较困难. 2、另外酶切连接过程本身也相当地费时费力. 二、优点: 1、克隆PCR产物较简便、快捷的方法. 2、不需使用含限制酶序列的引物,不需将 PCR 产物进行优化,不需把PCR产物做平端处理...
衷肃15260027688问： 3K的PCR片段连T载体,怎么连才好连 - ？
泸溪县节宗回答： 第一,先确定聚合酶能不能末端加A,如果不想,用cDNA做模板pcr,末端加上A.第二,合适的比例,你这个建议mol比1:1连接.连之前先在65度的水里浴下,混匀后加连接酶.
衷肃15260027688问： 链接载体和粘性片段时 片段量过多有什么影响 - ？
泸溪县节宗回答： 关键是这个粘性末端带的是什么.因为t 载体的末端是突出的t.如果直接是pcr产物,需要考虑,用taq酶扩增的片段可以直接连,如果是高保真酶扩增的片段,需要用taq酶加a尾,大约30min左右. 如果是已经经过酶切的片段,确实要补平加a.如果是这样,为什么不直接去连目标载体呢?
衷肃15260027688问： T载体指什么? - ？
泸溪县节宗回答： 应该是分子克隆用的载体,使用前是双链线性片段,上面有必要的测序或表达元件,两头是黏末端,各在3'有一个游离的T(故名T载体).因为PCR实验中用的聚合酶大部分都是taq和taq的同类酶,会在PCR产物的3'末端自动加一个A,这样PCR产物纯化之后无需酶切就可以与T载体连接,连接结果为带有目的片段的环状质粒载体.之后转化挑克隆,进行表达和测序.
衷肃15260027688问： 求助pGL3 - basic质粒Sanger测序引物选择 - ？
泸溪县节宗回答： 先连接T载体是为了提高转化效率一般来说市面上出售的T载体都进行了优化,容易连接片段(也就是效率较高),因此构建表达载体时有时会先连接T载体.同时T载体的测序引物比较明确(商业化的缘故),因此测序也方便一些.更重要的是,T载体往往设计了蓝白斑筛选的功能,插入片段的载体会呈现白色,这样也容易区分验证,不用每个单菌落都拿去做colony PCR或提质粒酶切验证.当然也不是绝对的,我们实验室就经常直接把片段酶切后连接表达载体,不经过T载体这一步,其实影响并不大.如果你的情况比较特殊(比如片段较大,或是对应的表达载体拷贝数较低等),可以考虑连接T载体,不然的话不是非常必要.
衷肃15260027688问： 连接到T载体上面后,做双酶切,条带不正确,目的片段变大是什么原因 - ？
泸溪县节宗回答： 为啥要连到T载体上做双酶切 直接切不就得了 跑胶只是看个大概的大小啦 不准的 变大几百都算正常 只要你测序没问题就可以了
