在蛋白类药物的提取分离时，如何避免蛋白质失活？
蛋白质组 蛋白质组(Proteome)的概念最先由Marc Wilkins提出，指由一个基因组(genOME)，或一个细胞、组织表达的所有蛋白质(PROTein). 蛋白质组的概念与基因组的概念有许多差别，它随着组织、甚至环境状态的不同而改变. 在转录时，一个基因可以多种mRNA形式剪接，并且，同一蛋白可能以许多形式进行翻译后的修饰. 故一个蛋白质组不是一个基因组的直接产物，蛋白质组中蛋白质的数目有时可以超过基因组的数目. 蛋白质组学(Proteomics)处于早期“发育”状态，这个领域的专家否认它是单纯的方法学，就像基因组学一样，不是一个封闭的、概念化的稳定的知识体系，而是一个领域. 蛋白质组学集中于动态描述基因调节，对基因表达的蛋白质水平进行定量的测定，鉴定疾病、药物对生命过程的影响，以及解释基因表达调控的机制. 作为一门科学，蛋白质组研究并非从零开始，它是已有20多年历史的蛋白质(多肽)谱和基因产物图谱技术的一种延伸. 多肽图谱依靠双向电泳(Two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)和进一步的图象分析；而基因产物图谱依靠多种分离后的分析，如质谱技术、氨基酸组分分析等.
[编辑本段]蛋白质组学的研究内容
主要有两方面，一是结构蛋白质组学，二是功能蛋白质组学。其研究前沿大致分为三个方面：
① 针对有关基因组或转录组数据库的生物体或组织细胞，建立其蛋白质组或亚蛋白质组及其蛋白质组连锁群，即组成性蛋白质组学。
② 以重要生命过程或人类重大疾病为对象，进行重要生理病理体系或过程的局部蛋白质组或比较蛋白质组学。
③ 通过多种先进技术研究蛋白质之间的相互作用，绘制某个体系的蛋白，即相互作用蛋白质组学，又称为“细胞图谱”蛋白质组学。
此外，随着蛋白质组学研究的深入，又出现了一些新的研究方向，如亚细胞蛋白质组学、定量蛋白质组学等。
[编辑本段]蛋白质组学研究中的主要技术
1 双向凝胶电泳技术(2-DE)
双向凝胶电泳技术与质谱技术是目前应用最为广泛的研究蛋白质组学的方法。双向凝胶电泳技术利用蛋白质的等电点和分子量差别将各种蛋白质区分开来。虽然二维凝胶电泳难以辨别低丰度蛋白，对操作要求也较高，但其通量高、分辨率和重复性好以及可与质谱联用的特点，使其成为目前最流行、可靠的蛋白质组研究手段。双向凝胶电泳技术及质谱基础的蛋白质组学研究程序为样品制备→等电聚焦→聚丙烯酰胺凝胶电泳→凝胶染色→挖取感兴趣的蛋白质点→胶内酶切→质谱分析确定肽指纹图谱或部分氨基酸序列→利用数据库确定蛋白。蛋白质组研究要求有高分辨率的蛋白质分离及准确、灵敏的质谱鉴定技术。凝胶电泳中蛋白质的着色不仅影响蛋白质分离的分辨率，同时也影响后续的质谱鉴定。蛋白质的染色可分为有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色四类。
Unlu 等提出了一种荧光差异显示双向电泳(F-2D-DIGE)的定量蛋白质组学分析方法。差异凝胶电泳(DIGE)是对2-DE 在技术上的改进，结合了多重荧光分析的方法，在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品，并第一次引入了内标的概念。两种样品中的蛋白质采用不同的荧光标记后混合，进行2-DE，用来检测蛋白质在两种样品中表达情况，极大地提高了结果的准确性、可靠性和可重复性。在DIGE技术中，每个蛋白点都有它自己的内标，并且软件可全自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准，保证所检测到的蛋白丰度变化是真实的。DIGE 技术已经在各种样品中得到应用。
2 高效液相色谱技术(HPLC)
尽管二维凝胶电泳（2-DE）是目前常用的对全蛋白组的分析方法，但其存在分离能力有限、存在歧视效应、操作程序复杂等缺陷。对于分析动态范围大、低丰度以及疏水性蛋白质的研究往往很难得到满意的结果。Chong 等使用HPLC/ 质谱比较分析恶性肿瘤前和癌症两种蛋白质差异表达。利用HPLC 分离蛋白质，并用MALDI-TOF-MS 鉴定收集的组分，从而在两种细胞中的差异表达中对蛋白质进行定量分析。多维液相色谱作为一种新型分离技术，不存在相对分子质量和等电点的限制，通过不同模式的组合，消除了二维凝胶电泳的歧视效应，具有峰容量高、便于自动化等特点。二维离子交换- 反相色谱(2D-IEC-RPLC)是蛋白质组学研究中最常用的多维液相色谱分离系统。
3 表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(SEL-DI)技术
表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱技术于2002 年由诺贝尔化学奖得主田中发明，刚刚产生便引起学术界的高度重视。SELDI 技术是目前蛋白质组学研究中比较理想的技术平台，其全称是表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术(SELDI-tof)。其方法主要如下：通常情况下将样品经过简单的预处理后直接滴加到表面经过特殊修饰的芯片上，既可比较两个样品之间的差异蛋白，也可获得样品的蛋白质总览。因此，在应用方面具有显著优势。 SELDI 技术分析的样品不需用液相色谱或气相色谱预先纯化，因此可用于分析复杂的生物样品。SELDI 技术可以分析疏水性蛋白质，PI 过高或过低的蛋白质以及低分子质量的蛋白质( < 25 000) ，还可以发现在未经处理的样品中许多被掩盖的低浓度蛋白质，增加发现生物标志物的机会。SELDI 技术只需少量样品，在较短时间内就可以得到结果，且试验重复性好，适合临床诊断及大规模筛选与疾病相关的生物标志物，特别是它可直接检测不经处理的尿液、血液、脑脊液、关节腔滑液、支气管洗出液、细胞裂解液和各种分泌物等， 从而可检测到样品中目标蛋白质的分子量、PI、糖基化位点、磷酸化位点等参数。
4 同位素标记亲和标签(ICAT)技术
同位素亲和标签技术是近年发展起来的一种用于蛋白质分离分析技术，此技术目前是蛋白质组研究技术中的核心技术之一。该技术用具有不同质量的同位素亲和标签( ICATs) 标记处于不同状态下的细胞中的半胱氨酸，利用串联质谱技术，对混合的样品进行质谱分析。来自两个样品中的同一类蛋白质会形成易于辨识比较的两个不同的峰形，能非常准确的比较出两份样品蛋白质表达水平的不同。ICAT 的好处在于它可以对混合样品直接测试；能够快速定性和定量鉴定低丰度蛋白质，尤其是膜蛋白等疏水性蛋白等；还可以快速找出重要功能蛋白质。
由于采用了一种全新的ICAT 试剂，同时结合了液相色谱和串联质谱，因此不但明显弥补了双向电泳技术的不足，同时还使高通量、自动化蛋白质组分析更趋简单、准确和快速，代表着蛋白质组分析技术的主要发展方向。针对磷酸化蛋白分析以及与固相技术相结合ICAT 技术本身又取得了许多有意义的进展，已形成ICA T 系列技术。用具有不同质量的同位素亲和标签( ICATs) 标记处于不同状态下的细胞中的半胱氨酸，利用串联质谱技术，可对混合的样品进行质谱分析。
5 生物信息学
近年来，生物信息学在生命科学研究中起着越来越重要的作用。利用生物信息学对蛋白质组的各种数据进行处理和分析，也是蛋白质组研究的重要内容。生物信息学是蛋白质组学研究中不可缺少的一部分。生物信息学的发展，已不仅是单纯的对基因组、蛋白质组数据的分析，而且可以对已知的或新的基因产物进行全面分析。在蛋白质组数据库中储存了有机体、组织或细胞所表达的全部蛋白质信息，通过用鼠标点击双向凝胶电泳图谱上的蛋白质点就可获得
如蛋白质鉴定结果、蛋白质的亚细胞定位、蛋白质在不同条件下的表达水平等信息。目前应用最普遍的数据库是NRDB 和dbEST 数据库。NRDB 由SWISS2PROT 和GENPETP 等几个数据库组成，dbEST是由美国国家生物技术信息中心（NCBI）和欧洲生物信息学研究所(EBI)共同编辑的核酸数据库；计算机分析软件主要有蛋白质双向电泳图谱分析软件、蛋白质鉴定软件、蛋白质结构和功能预测软件等。
一般蛋白质在水性溶液中就能溶解。不知你做的是什么蛋白?如果是变性蛋白则温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用
您好！蛋白质在溶液中容易受到温度、蛋白酶、pH、盐类等的影响而失活。① 温度：一般的蛋白都不耐高温，所以在提取及储存过程中应注意进行温度控制，一般过程样品等都应放置在4℃。
② 蛋白酶：为防止蛋白受到蛋白酶的作用降解失活，一般会加入如EDTA金属螯合剂，PMSF之类的蛋白酶抑制剂等，另低温也可以起到一定的抑制蛋白酶作用。
③ pH：应采用有足够缓冲容量的缓冲体系防止pH过度的变化，缓冲液pH范围根据蛋白稳定性来确定。尤其是加入大量盐类如盐析等时应特别注意。
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感谢您的采纳，O(∩_∩)O 如有疑问，欢迎追问。
温度、pH值、提取物中混杂的蛋白酶确实是一个重要的考量，另外提取工艺也会影响到蛋白类药物的活性，例如分子筛分离、样品浓缩时，缓冲液离子强度、压强、流速等也可能影响蛋白活性；
是否可以考虑加蛋白酶抑制剂
蛋白质类药物的分离纯化方法有哪些?
请问你的目的蛋白分子量是多少，等电点多少，之后可以选择超滤、盐析、色谱逞层析。
药物提取分离要什么设备
如 试管、锥形瓶、玻璃棒、酒精灯、滴管、量筒、三脚架、铁甲台、滴定管、烧杯、棉塞、滤纸、火柴、蒸发皿、坩埚钳、载玻片、研钵（杵）、试管夹、试管架、冷凝管、漏斗、………然后专业一些的器具，比如说索氏提取器装备、离心机、蛋白分离仪器、色谱分析仪等，你要是真想提取药物，要看药物的化学性...
胶原蛋白的提取分离
酸法提取是利用一定浓度的酸溶液在一定的条件下提取胶原蛋白,主要采用低离子浓度酸性条件破坏分子间盐键和希夫碱,而引起纤维膨胀、溶解,采用酸法提取的胶原蛋白通常成为酸溶性胶原蛋白。酸溶解法可将没有交联的胶原分子溶解出来,也可溶解含有醛胺类交联键的胶原纤维,然后释放到溶剂中。酸法是提取胶原蛋白比较常用和...
药物分析:常用定量分析法与应用——理化法
1.反相高效液相色谱法（rp－hplc）以（c4、c8、c18）烷基硅烷键合相为柱填料，以甲醇-水、乙腈-水或甲醇、乙腈与缓冲液构成的溶液为流动相，以紫外、荧光或电化学检测器为检测手段，这种色谱体系在生化药物（例如肽类、氨基酸、蛋白质、多糖等）定量分析中应用广泛。例如：生白能（leucomax）的含量测定...
多肽和蛋白质类药物的分析方法
由于蛋白多肽类药物多为有生物活性的物质,且生物活性不仅取决于药物的一级结构,与二 、三级结构亦密切相关,故生物检定法是研究该类药物动力学独特而必需的方法。生物检定 法 有两个目的,直接测定体液中药物浓度及鉴定标记药物的生物活性。其方法主要可分为两大 类。1.1.1 在体分析 常规的有胰岛素的小鼠血糖法等,...
关于蛋白质多肽类药物
蛋白质多肽类药物 ,因生理活性强、 疗效高而日益受到重视。为了正确评价蛋白质多肽类药物的疗效及安全性 ,必须研究其在动物和人体内的吸收、 分布、 代谢和排泄的规律。蛋白多肽类药物在实现商品化过程中 , 受到诸多因素的制约 , 而药物动力学的研究面临更严重的挑战。与小分子药物相比 ,蛋白多肽类药物具有相对分子...
生物制药工艺学萃取分离有哪些方法
工业生产主要应用细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类微生物。它们对营养的要求既有共性,也有各自的特性,应根据不同类型微生物的生理特性考虑培养基的组成。(2)其次,对生产菌种的培养条件,生物合成的代谢途径,代谢产物的化学性质、分子结构、一般提取方法和产品质量要求等也需要有所了解,以便在选择培养基时做到心中有数...
简述中草药有效成分提取和分离方法
3、超微粉碎技术 是利用超声粉碎、超低温粉碎技术，使生药中心粒径在5～10μm以下，细胞破壁率达到95%。药效成分易于提取也容易被人体直接吸收。适合于各种不同质地的药材，而且可使其中的有效成分直接暴露出来，从而使药材成分的溶出和起效更加迅速完全。4、药絮凝分离技术 将絮凝剂加到中药的水提液中...
福林酚法测定蛋白含量
首先，需要将样品中的蛋白质提取出来，这通常需要用到如变性剂、还原剂等物质。然后，将提取出的蛋白质与碱性溶液反应，形成碱性氨基酸。接下来，加入福林酚试剂，等待显色反应发生。最后，用分光光度计测量样品的吸光度。3 、用途 福林酚法是一种灵敏度高、特异性好的蛋白质定量方法。其用途广泛，如在...
2017药物分析:体内样品处理
※ 蛋白分解法——蛋白水解酶(枯草菌溶素)考点3：缀合物水解法 ※ 酸水解(HCl)：简便、快速，但专一性差 ※ 酶水解：β-葡萄糖醛酸苷酶、硫酸酯酶、两者混合酶，专属性高 考点4：分离纯化与浓集常用方法 ※ 液-液萃取——选用与水不相混溶的有机溶剂进行提取 ※ 离子对萃取法 ※ 固相萃取法...
利顺小儿： 您好!蛋白质在溶液中容易受到温度、蛋白酶、pH、盐类等的影响而失活. ① 温度:一般的蛋白都不耐高温,所以在提取及储存过程中应注意进行温度控制,一般过程样品等都应放置在4℃. ② 蛋白酶:为防止蛋白受到蛋白酶的作用降解失活,一般会加入如EDTA金属螯合剂,PMSF之类的蛋白酶抑制剂等,另低温也可以起到一定的抑制蛋白酶作用. ③ pH:应采用有足够缓冲容量的缓冲体系防止pH过度的变化,缓冲液pH范围根据蛋白稳定性来确定.尤其是加入大量盐类如盐析等时应特别注意. 百度教育团队【海纳百川团】为您解答. 感谢您的采纳,O(∩_∩)O 如有疑问,欢迎追问.
平安县13735793059： 如何防止蛋白质在分离纯化过程中变性 - ？
利顺小儿： 防止蛋白质在分离纯化过程中变性,主要还是控制温度,pH,盐浓度这几个容易造成蛋白质变性的条件 温度一般是尽量保持低温 pH和盐浓度都是针对不同的蛋白有不同的合适范围
平安县13735793059： 蛋白质提取时注意什么操作中应如何控制 - ？
利顺小儿： 尽量在低温进行,一定要加蛋白酶抑制剂,防止降解.
平安县13735793059： 蛋白质,核酸,酶在分离纯化的时候为了防止变性应该注意什么? - ？
利顺小儿： 蛋白质与核酸分离纯化的时候,需要注意的地方是不同的.对于蛋白质,尤其是酶类首先要注意的就是温度,很多蛋白质都是热敏感性的,你必须要注意低温操作,所有的步骤最好是在4度的环境下进行.接着要注意的就是避免使用一些会造成...
平安县13735793059： 在做蛋白质类药物时怎么保证蛋白质的活性? - ？
利顺小儿： 在低温环境下进行 加入一些保护剂等
平安县13735793059： 溶液中的蛋白质对药物分离纯化过程有哪些影响? - ？
利顺小儿： 溶液中的蛋白质会络合某种药物,因此在分离之前需要把溶液中的蛋白质分离之后再进行药物的纯化.
平安县13735793059： 蛋白质分离纯化过程中遇见的常见问题有哪些 - ？
利顺小儿： 常见问题有:纯化方法如何建立,在建立过程中需要考虑回收率,活性等. 解决方案就是就具体样品具体讨论,根据样品的各种信息来判断实验思路.
平安县13735793059： 酶作为特殊蛋白质在提纯的时候应该要注意哪些方面? - ？
利顺小儿： 酶作为特殊的蛋白质,最重要的原则是一定在纯化过程中保持酶的活性,所以纯化过程中一般要注意保持低温、缓冲液配方,避免酶的抑制.
平安县13735793059： 基因药物(蛋白质药物)的分离纯化技术要点 - ？
利顺小儿： 请问你的目的蛋白分子量是多少,等电点多少,之后可以选择超滤、盐析、色谱逞层析. 蛋白质药物分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要得目的蛋白质的方法. 是当代生物产业当中的核心技术.该技术难度、成本...
平安县13735793059： 低温乙醇法影响血浆蛋白提取的因素有哪些? - ？
利顺小儿： 方法原理:往蛋白水溶液中加入中溶性有机溶剂,如乙醇丙酮等,主要是降低水分子的活度,降低溶液的界定常数,从蛋白分子周围排斥水分子,使蛋白分子之间通过急性集团的相互作用,在范德华力作用下发生凝聚,不过由于有机溶剂存在,降低了蛋白分子表面疏水基团的作用,因而引起蛋白分子凝聚. 影响因素:第1乙醇使蛋白质分子脱水,第二ph值蛋白质在等电点时易于沉淀.第三,电解质浓度在低离子浓度下对蛋白质溶解度有较大影响,第四,蛋白质浓度浓度越低,其沉淀作用越小.第五温度,在低温下可以避免乙醇对蛋白质的变性作用,同时蛋白质溶解为吸热反应,溶解度随温度上升而增高.
