免疫组化 如何复染（免疫组化，苏木精，盐酸，石
作者&投稿：喻皇 （若有异议请与网页底部的电邮联系）
可以计算阳性率阿，所有细胞核都被着色，阳性细胞是双染的。阴性的只有细胞核着色。根据要求看，做了结果多一些，呵呵，其实很简单的。
得看你的片子是石蜡的还是冰冻的，一般可以用苏木素，染后结果看得清楚，分化时间不要太长，这样图能好看一点，不分化也可以，就是蓝的地方太蓝了
（一）、仪器设备1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2）水浴锅
（二）、试剂
1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L.
2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g.
3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0，加水至1000ml.
4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0，加水至1000ml.
5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2（pH7.8） 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
7）封裱剂：
a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合；
b、油和TBS（或PBS）配制。
8）TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。
（三）、操作流程
1、脱蜡和水化
脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；
2）无水乙醇中浸泡5分钟；
3）95%乙醇中浸泡5分钟；
4）70%乙醇中浸泡5分钟；
2、抗原修复
用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。
1）抗原热修复
（1）高压热修复 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
（2）煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。
（3）微波热修复 在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。
2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。
3、免疫组织化学染色
SP法
1）脱蜡、水化；
2）PBS洗2～3次各5分钟；
3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；
4）PBS洗2～3次各5分钟； 5）抗原修复；
6）PBS洗2～3次各5分钟；
7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。
8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。
9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。
10）PBS洗3次各5分钟；
11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；
12）II抗中可加入0.05%的tween-20.
13）PBS洗3次各5分钟；
14）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；
15）PBS或自来水冲洗10分钟；
16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；
17）自来水冲洗10～15分钟；
18）脱水、透明、封片、镜检。
SABC法
1）脱蜡、水化。
2）PBS洗两次各5分钟。
3）用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。
4）抗原修复。
5）PBS洗5分钟。
6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。
7）滴加Ⅰ抗，室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。
8）PBS洗三次每次2分钟。
9）滴加生物素化二抗，20℃～37℃20分钟。
10）PBC洗3次每次2分钟。
11）滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟。
12）PBS洗4次每次5分钟。
13）DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。
14）蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。
15）脱水、透明、封片、镜检。
征容常胜：[答案] 你所给的结果出现乱码,请用相机拍清晰后上传正式的病理免疫组化结果.
乡城县19458809019： 请问用免疫组化半定量分析某组织中某种蛋白的表达,优缺点是什么?免疫组化半定量分析和Western blot、ELISA的方法在检测组织蛋白表达量上有什么不... - ？
征容常胜：[答案] 这三个方法检测蛋白灵敏度不同,逐渐增高,免疫组化理论上可以半定量,但是得看你检测的指标敏感度如何,如果本来表达就低,根部定不了量,WB可以定量,建议如果做科研建议先做组化,在做wb
乡城县19458809019： 免疫组化检测结果是什么意思 - ？
征容常胜：[答案] 免疫组化是目前临床上常用的病理学检测方法,多用于鉴别形态很相似的疾病或肿瘤,确定组织来源及研究肿瘤组织代谢改变,它包括细胞内酶学的变化、糖原的变化、核酸的变化. 您的免疫组化检查结果可能是为了检测是否患有恶性淋巴瘤,淋巴...
乡城县19458809019： 免疫组化CDll7十 CD34十 S一100一 Ki一67(<5%十)是什么意思 - ？
征容常胜：[答案] 免疫组化是目前临床上常用的病理学检测方法,多用于鉴别形态很相似的疾病或肿瘤,确定组织来源及研究肿瘤组织代谢改变,它包括细胞内酶学的变化、糖原的变化、核酸的变化. 您的免疫组化检查结果可能是为了检测是否患有恶性淋巴瘤,淋巴...
