研究细胞凋亡使用什么细胞株

如何诱导建立耐药肿瘤细胞株~

肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性是造成化疗失败的主要原因，体内外研究发现肿瘤耐药的分子机制很复杂，包括靶基因突变、靶基因扩增、DNA损伤修复能力差异、药物进入肿瘤细胞内浓度减少等。本文主要从肿瘤细胞内在的分子异常如原癌基因表达异常、DNA损伤修复基因表达异常及多药耐药有关基因表达异常等几个方面综述了肿瘤耐药的一些分子机制进展。 1原癌基因表达异常 许多原癌基因参与调节细胞的增殖与凋亡，这些基因的改变导致分子调节缺陷使细胞恶变，并对生理刺激作出凋亡的反应能力降低，而诱导肿瘤细胞凋亡是化疗药物作用的重要机制。因此抑制癌细胞凋亡的原癌基因表达异常参与了肿瘤细胞的抗药性，这主要包括P53 、Rb、Bcl 2三种原癌基因。 1.1P53 原癌基因野生型P53 (wtP53 )基因是一种抗癌基因，其产物是核内转录因子，作用是参与基因稳定。当细胞受损时wtP53 蛋白表达增高，诱导与DNA修复有关的基因GADD45表达，增加细胞DNA修复能力，同时通过诱导凋亡促进受损细胞死亡。近年认为P53 蛋白也能活化P21 waf 1基因表达，从而抑制细胞周期蛋白激酶复合物如Cyclin D/cdk4、Cyclin D/cdk6及Cyclin E/cdk2的活性，并增加Rb蛋白的去磷酸化，从而抑制损伤细胞由G 1进入S期，活化的P53 蛋白水平增高能降低细胞发生凋亡反应的阈值，当受损细胞不能修复DNA时则进入凋亡［1］。P53 基因突变消除了许多依赖P53的反应，增加了染色体不稳定性，从而使肿瘤细胞在有DNA损伤的情况下进入细胞周期，抗药性的肿瘤细胞被筛选出来，并且产生有利于基因扩增的条件，使嘌呤、嘧啶生物合成特异性的酶基因扩增，产生对抗代谢类药物如氨甲蝶呤的耐药性。另一方面，P53 基因突变的肿瘤细胞株对凋亡的敏感性下降从而产生耐受化疗药物的特性，研究发现P53 突变的肿瘤细胞导入外源野生型P53 基因后增强化疗药物5-Fu的细胞杀伤作用，这些结果表明wtP53 突变参与了肿瘤细胞对化疗药物的抗性［2］。 1.2Rb原癌基因 Rb基因产物是一种核内蛋白，起反式作用因子的作用。Rb蛋白能与一种细胞生长调节因子E2F形成复合物，抑制E2F诱导S期基因如DNA聚合酶、胸腺嘧啶合成酶、二氢叶酸还原酶等基因的表达，从而抑制细胞的增殖。细胞周期蛋白Cyclin D家族通过使Rb蛋白磷酸化，抑制其与E2F形成复合物，增加自由E2F因子释放，参与了Rb蛋白网络控制细胞由G1期向S期转变的过程。因此，当Rb基因突变或Cyclin D 1蛋白表达增高，则使E2F因子活性增强从而使E2F诱导的S期基因表达增高，使肿瘤细胞对化疗药物氨甲蝶呤敏感性下降［3］。 1.3Bcl2原癌基因家族Bcl2基因是在人滤泡淋巴瘤细胞14、18号染色体异位时发现的，但Bcl2蛋白本身并无促进细胞周期进行和使细胞分裂的作用。研究发现Bcl2作为一种抗凋亡基因能专一性抑制许多刺激导致的细胞凋亡，作用机理可能与抑制野生型P53蛋白活性、抑制C myc诱导的凋亡、与bax蛋白形成异聚体抑制其活性有关。在人前列腺癌、结肠癌等肿瘤中发现有Bcl2蛋白过表达，并发现过表达Bcl2的腺癌对化疗药物阿糖胞苷等有抗药性［4］，Bcl2基因家族中的Bcl XL也能与Bax蛋白形成复合物，抑制其诱导凋亡的活性。在白血病高度耐药株P388 中发现，Bcl XL水平显著增高，并与肿瘤细胞耐药性相关［5］。2DNA损伤修复能力异常许多化疗药物如氮芥、顺铂等通过损伤DNA如使DNA链间交联达到杀伤肿瘤目的，当肿瘤细胞修复DNA损伤的能力增强，则使肿瘤对化疗药物产生抗性。近来发现另一类化疗药物，能选择性抑制拓扑酶使DNA链断裂，不同的抑制物能与拓扑酶以共价复合物形式稳定在DNA不同位点，通常是DNA核基质附着区和c myc基因活化转录区，使DNA链断裂导致细胞死亡。当肿瘤细胞拓扑酶发生改变如拓扑酶Ⅱ转录水平和活性降低或者肿瘤细胞拓扑酶Ⅰ突变，使肿瘤细胞对化疗药物拓扑酶抑制物产生耐药性［6］ 。另一方面，研究发现O 甲基鸟嘌呤 DNA甲基转移酶MGMT能清除O 6 乙基鸟嘌呤并与N1O6 乙醇鸟嘌呤反应形成一种不可逆的复合物，从而抑制了N 3C N 1G链间交合物的形成，缺少MGMT的肿瘤细胞株对化疗物苄氯亚硝基脲CENUs高度敏感，而转染人MGMT进入缺乏此酶的细胞株后发现链间交联形成减少并对CENUs产生抗性。在脑肿瘤中，低水平MGMT的表达与卡氮芥碱基治疗效果转好有关［7，8］ 。体外发现DNA错配修复与识别错配位点的蛋白hMSH2(人Muts同源物2)、GTBP(G T结合蛋白二异聚体)和结合此异二聚体的hMLH1蛋白(人Mutl同源物)有关。hMSH2或hMLH 1缺失导致肿瘤的发生及对顺铂产生低水平耐受［9］ 。另外损伤识别蛋白DPR s与铂抗性有关，DPRs是一类含迁移基因HMG的蛋白，选择性地与顺铂 GG和 AG链间双聚物结合后，丧失其转录因子的正常功能，从而影响特异基因的转录使肿瘤细胞产生铂抗性。酵母菌编码HMG蛋白的IXR1基因活性缺失，可对顺铂产生两倍抗性［10］ 。紫外线损伤识别蛋白UVDRP与紫外线诱导的6，4 光合物高度特异性结合，这种DPR蛋白在顺铂耐性肿瘤细胞株中表达活性增加［11］。近年来有文献报道DNA聚合酶α、β在苯丙氨酸、氮芥和铂耐性细胞株中表达大大增高。体内用顺铂治疗后，肿瘤细胞的DNA聚合酶α、β和DNA连接酶活性大大增加［12］，使肿瘤细胞在有DNA链损伤的情况下仍能进行复制，在细胞G2期清除链间交联、DNA链间双聚体，并抑制P53诱导的凋亡，从而产生铂耐性。在对铂化疗无反应的恶性卵巢癌患者的肿瘤组织中发现与核酸有关的切除修复基因P33 和P31 基因表达远高于铂化疗有效的患者。在白血病患者的研究中发现P33 过表达与其对氮芥的耐药性有关［13］ 。因此DNA修复有关的酶活性增高是肿瘤对化疗药物产生抗性一个重要原因，筛选与DNA修复有关的选择性抑制剂能增加化疗效果。 3多药耐药有关基因表达异常 肿瘤细胞对多种化疗药物产生交叉抗药性的造成肿瘤化疗失败的一个重要原因。研究发现这种耐药方式即在人肿瘤中和培养的肿瘤细胞株中出现多药耐药的产生机制与多种因素如多药耐药基因、谷胱甘肽转移酶、蛋白激酶C等有关。多药耐药基因MDR定位于第7号染色体，这个基因蛋白编码区由27个外显子组成，其编码的170KD的P糖蛋白，属于腺苷三磷酸结合蛋白超家族成员。P 糖蛋白在耐药细胞膜上过度表达，可将细胞内的化疗药物泵出胞外，细胞内化疗药物达不到有效杀伤剂量而致耐药性产生。非经典型多药耐药如人HL60抗阿霉素等抗性细胞株，其内质网膜上表达一种110KD蛋白，因从肺癌细胞中分离到该蛋白基因故命名为肺抗性蛋白LRP 56，cDNA序列同源性分析中发现这种蛋白属于胞质穹窿蛋白，这种胞内穹窿蛋白是一种与核胞浆运输有关的细胞器。因此，LRP 56的作用途径可能是：一方面通过降低药物的核质分布比率以降低药物的有效浓度，另一方面通过囊泡转运和胞吐机制将胞质内药物排出细胞外，降低药物的绝对浓度。许多人肿瘤细胞株和实体瘤中均有LRP 56蛋白表达，在人结肠直肠癌中LRP 56有高表达［14］ ，血液系统肿瘤及实体瘤的LRP 56表达水平也与化疗敏感性有关。此外，在P糖蛋白表达阴性的胀瘤细胞株中发现多药耐药相关蛋白MRP，MRP编码mRNA7.8～8.2 kb,定位于染色体16 p13.1,MRP产物为190KD的膜结合糖蛋白，克隆及转化实验发现MRP基因能使肿瘤细胞对多种药物产生抗性［15］。体内外的实验证实，谷胱甘肽转移酶GST能催化谷胱甘肽与药物形成复合物而解毒，肿瘤细胞的GST活性增高从而产生耐药性。研究发现GST家族中GST π水平在人肿瘤组织如胃癌、结肠癌、肺癌表达增高，许多肿瘤细胞株对化疗药物苯丙氨酸芥、环磷酰胺的抗药性与GST π表达水平的增高。利用反义技术阻断肿瘤细胞GST π表达，可明显增强其对各种化疗药物的敏感性［16］ 。另一种药物代谢机制与亲核物质如氮硫等和葡萄糖醛酸结合有关，这是由葡萄糖醛酸转移酶UDPGTS这一类大家族催化。在鼠白血病细胞株P338 就发现UDPGTS水平增高并灭活有代谢毒性的daunorubicinol，并对其产生抗药性［17］。蛋白激酶C是一种Ca2+ /磷脂依赖的同功酶，由单一多肽链组成，包含钙依赖性的巯基蛋白酶分解的两个不同部位和含有ATP及底物蛋白结合区域的亲水性催化部位/活性中心。在体外建立的耐药细胞株与相应的敏感株相比，蛋白激酶C活性明显增高。研究表明蛋白激酶Cα对肿瘤多药耐的形成起重要作用，但各种肿瘤组织的蛋白激酶C存在异质性。蛋白激酶C可能通过磷酸化耐药基因编码的膜蛋白调节其转运功能或通过核内的基因转录参与肿瘤的多药耐药形成。因此，有必要对蛋白激酶C在多药耐药发生、发展中的作用做进一步研究［18］。综上所述，肿瘤细胞对化疗药物产生抗性的机制是复杂的。针对肿瘤细胞原癌基因表达异常，人们利用基因治疗的方法将正常的基因导入细胞增加其对化疗敏感性，而许多化合物如钙离子通道阻滞剂具有逆转肿瘤细胞多药耐药的作用。因此临床化疗应联合不同作用机理的药物、不同的治疗方法才能达到良好的临床疗效。

细胞凋亡检测可以：（1）用于肿瘤细胞和组织在内的不同种类病理标本研究；（2）应用于临床诊疗，新药研制、生物制品开发、肿瘤放化疗、以及从促凋亡角度探索肿瘤的基因治疗；（3）对相关疾病的早期发现、放化疗的疗效评价具有举足轻重的地位。
荧光探针双标记法
实验原理
本实验用1μg/ml 三尖杉酯碱HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）对细胞进行双重染色，可以区别凋亡、坏死及正常细胞。

三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。

细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时，质膜不完整，PI就进入细胞内部，它可嵌入到DNA或RNA中，使坏死细胞着色，凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，因而可进行活细胞染色。Hoechst33342是一种活性荧光染料且毒性较弱，它是双苯并咪唑的一种衍生物。与DNA特异结合（主要结合于A-T）碱基区），显示凋亡细胞和活细胞。凡是看到有凋亡小体的细胞都是凋亡细胞。
实验材料
人早幼粒白血病HL-60细胞
试剂/试剂盒
三尖杉酯碱 Tris-Hcl EDTA缓冲液 碱性裂解液 SDS 醋酸钠 异丙醇 乙醇 溴酚蓝 蔗糖指示剂 TBE电泳缓冲液 琼脂糖 溴乙锭 PI母液 Ho33342母液
仪器/耗材
荧光显微镜 电泳仪 电泳槽 微量加样器 离心管 载玻片 盖玻片

细胞凋亡检测可以：（1）用于肿瘤细胞和组织在内的不同种类病理标本研究；（2）应用于临床诊疗，新药研制、生物制品开发、肿瘤放化疗、以及从促凋亡角度探索肿瘤的基因治疗；（3）对相关疾病的早期发现、放化疗的疗效评价具有举足轻重的地位。
荧光探针双标记法
实验原理
本实验用1μg/ml 三尖杉酯碱HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）对细胞进行双重染色，可以区别凋亡、坏死及正常细胞。

三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。

细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时，质膜不完整，PI就进入细胞内部，它可嵌入到DNA或RNA中，使坏死细胞着色，凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，因而可进行活细胞染色。Hoechst33342是一种活性荧光染料且毒性较弱，它是双苯并咪唑的一种衍生物。与DNA特异结合（主要结合于A-T）碱基区），显示凋亡细胞和活细胞。凡是看到有凋亡小体的细胞都是凋亡细胞。
实验材料
人早幼粒白血病HL-60细胞
试剂/试剂盒
三尖杉酯碱 Tris-Hcl EDTA缓冲液 碱性裂解液 SDS 醋酸钠 异丙醇 乙醇 溴酚蓝 蔗糖指示剂 TBE电泳缓冲液 琼脂糖 溴乙锭 PI母液 Ho33342母液
仪器/耗材
荧光显微镜 电泳仪 电泳槽 微量加样器 离心管 载玻片 盖玻片

---

龙沙区13597486664： 检测细胞凋亡的三种常用方法,您知道几种 - ？
景鸣怡新： 一、形态学观察方法 二、DNA凝胶电泳 三、酶联免疫吸附法 四、流式细胞仪定量分析

龙沙区13597486664： 动物细胞凋亡和植物细胞凋亡的区别是什么 - ？
景鸣怡新： 能同时鉴别和研究悬浮培养的植物细胞凋亡及坏死的新方法——Hoechst-PI- SDH三重染色法(H-P-S法)、死细胞及凋亡细胞,可以提高血清浓度,并可同时观测细胞凋亡的全部过程、快速、准确,还有就是用标记annexinV的磁珠将凋亡和死...

龙沙区13597486664： dna ladder实验要不要无菌操作 - ？
景鸣怡新： dna ladder实验要不要无菌操作 DNA Ladder 法检测细胞凋亡方法如下: 1、凋亡处理:细胞经凋亡处理后,收集细胞(包括悬浮细胞),用70%乙醇-20度固定2h. 2、裂解细胞: 加400ml细胞裂解液,充分摇匀后再加蛋白酶K(10mg/ml),置65...

龙沙区13597486664： 检测细胞凋亡并计数的方法除了MTT法和流式细胞仪,还有什么其他方法吗? - ？
景鸣怡新： 要计数的话,就流式最好了.检测凋亡,除非是悬浮培养的细胞,一般都要染色.活细胞可以用caspase的底物染色,有配套试剂盒,是最简便快捷的方法,而且特异性好

龙沙区13597486664： 几种凋亡细胞检测方法的比较 - ？
景鸣怡新： 在细胞凋亡的基础研究领域,如有关凋亡信号转导、基因调控等方面的研究,以及在细胞凋亡的应用研究领域,诸如将细胞凋亡作为化疗药物的筛选模式、检测肿瘤组织切片中凋亡细胞数以评价肿瘤预后等,都涉及到凋亡细胞的识别与检测这一基本问题,因此,选择合适的检测凋亡细胞的方法便成为各个实验室必须解决的问题.本文结合相关文献及在研究中的体会,就凋亡细胞与坏死细胞的区别、几种常用凋亡细胞检测方法适用范围及应用中的影响因素、结果分析等简述如下.

龙沙区13597486664： 细胞凋亡常用的检测方法有哪些?？
景鸣怡新：1 光学显微镜和倒置显微镜 (1) 未染色细胞:凋亡细胞的体积变小、变形,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体. 贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落. (2) 染色细胞:常用姬姆萨染色、瑞氏染色等.凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割 成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态. 生物帮上面有这方面的专业介绍, http://www.bio1000.com/zt/product/357940.html bd流流式细胞仪,流式细胞仪原理,流式细胞仪,流式细胞仪的用途

龙沙区13597486664： 细胞凋亡有哪些检测方法? - ？
景鸣怡新： 1、HE染色、光镜观察:凋亡细胞呈圆形,胞核深染,胞质浓缩,染色质成团块状,细胞表面有“出芽”现象. 2、丫啶橙(AO)染色,荧光显微镜观察:活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光.凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,...

龙沙区13597486664： 细胞焦亡和细胞凋亡的区别 - ？
景鸣怡新： 1、定义 细胞焦亡(Pyroptosis)又称细胞炎性坏死,是一种程序性细胞死亡. 细胞凋亡(apoptosis)指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的死亡. 2、表现 细胞焦亡表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂,导致细胞内容物的释...

龙沙区13597486664： 免疫系统中,哪些细胞能够特异或非特异的杀伤靶细胞 - ？
景鸣怡新： 肿瘤的免疫监视及免疫逃逸一、机体的免疫监视功能免疫监视概念早在1909年由Ehrlich最先提出,认为机体中经常会出现的肿瘤细胞可被免疫系统(immune system)所识别,作为异物而加以清除.50年后,Thomas通过对机体细胞免疫进化...

龙沙区13597486664： 细胞凋亡的形态学检测方法有哪些 - ？
景鸣怡新： 形态学观察方法: 1、HE染色、光镜观察:凋亡细胞呈圆形,胞核深染,胞质浓缩,染色质成团块状,细胞表面有“出芽”现象. 2、丫啶橙(AO)染色,荧光显微镜观察:活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光.凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓...