IL-2活性测定问题

IL-2检测的检测方法有哪些？？~

细胞免疫（CMⅠ）是由多种细胞相互作用的结果。免疫细胞间相互作用导致多种细胞因子的释放。因此细胞功能测定不仅涉及T细胞的数量和功能与包括各类因子活性测定，因此评价机体的细胞免疫功能不仅程序复杂，且很难标准化 一、迟发型过敏反应的体外检测方法 皮肤试验和接触性过敏的诱发是检测迟发型过敏反应（DTH）的两种常用方法。皮肤试验中诱发对曾经使病人致敏的抗原的再次应答，而接触性过敏是测试受者对从未接触过的物质发生致敏的能力。 1．皮肤试验 用皮肤试验诊断DTH，常用的抗原有结核菌纯蛋白衍生物（PPD）、腮腺炎病毒、念珠菌素等，在人类试验时在前臂皮内注射少量可溶性抗原，24～48小后，测量红肿硬结的大小，硬结直径大于10mm即被看作为阳性。表明受试者对该病原菌有了一定的细胞免疫能力，若皮试无反应，可用更高浓度的抗原重复试验，若仍无反应即为阴性，需排除皮试技术误差，也可能受试者从未接触过此抗原，也可能由于细胞免疫功能缺损，或由于细胞免疫功能缺损，或由于严重感染（麻疹、慢性播散性结核）造成的无反应性。 2．接触性过敏常应用低分子量化合物如二硝基氯苯（DNCB）诱生接触性过敏。化合物与皮肤蛋白质结合而导至DTH反应。在动物试验时，初次皮肤上涂抹DNCB后间隔7～10天再激发刺激，则皮肤出现即为阳性。此试验人类已不使用。 二、细胞免疫的体外检测方法 体外检测淋巴细胞的数量和功能，最易采集的是血标本，首先需分离或纯化淋巴细胞，一般使用萄聚糖-泛影葡胺配成比重为1.077的淋巴细胞分层液，当将血液重叠于淋巴细胞分层液之上离心时，由于红细胞（1.092）、多形核白细胞（1.090）、淋巴细胞（1.070）的比重不同而相互分开。淋巴细胞和单核细胞在血浆和分层液交界处形成一薄层。仔细分出这一薄层的细胞，其中淋巴细胞占80%，单核细胞占20%，淋巴细胞中T细胞占80%，B细胞占4%～10%，其作为非DT、非B细胞。 1．T细胞计数 （1）E花环法：人类T细胞表面有SRBC受体（CD2）能与SRBC结合形成玫瑰花环样结构，将经分层液分离现的RBM悬液与SRBC在含有血清的平衡盐水中混合，经37℃培养5～10分钟放4℃过夜，取细胞悬计数，外周血淋巴细胞中约70%～80%淋巴细胞结成花环即为T细胞。目前此方法已用来分离T细胞，而不用做T细胞计数。 （2）用单克隆抗体计数T细胞：将人的PBM分成三等份，分别用小鼠抗人CD3、CD4和CD8的单克隆抗体作第一抗体与细胞结合，再用FITC标记的兔抗小鼠IgG抗体作第二抗体进行间接免疫荧光染色，在荧光显微镜下或流式细胞仪检测结果，在PBM中被CD3抗体染上荧光的细胞称为CD3+细胞即总T细胞。正常人在PBM中T细胞占70%～80%。正常人的CD4+细胞和CD8+细胞之和应与CD3+细胞数一致。CD4+细胞与CD8+细胞的比值正常人约为2/1而艾滋病患者则比值小于1.7。 2．T细胞活化试验 T细胞能被非特异的物质称为有丝分裂原所激活而向淋巴母细胞转化。T细胞转化过程可伴随有DNA、RNA、蛋白质的合成增加，最图导致细胞分裂。在光学显微镜下可计数转化后的淋巴细胞数，也可用氚标记的胸腺嘧啶核苷（3HTdR）掺入正在分裂的淋巴细胞，用液闪测定仪检查掺入正在分裂的淋巴细胞，用液测量仪检查掺入的3H-TdR的多少确定淋巴细胞转化率。最近有一种不用同位素，又可用仪器测量的淋巴细胞增殖反应的检查法，称为MTT检测法，MTT是一种甲氮唑盐，它是细胞线粒体脱氢酶的底物，细胞内的酶可将MTT分解产生蓝黑色甲（fromazan）产物。该产物的多少与活性细胞数正相关。结果可用酶标检测仪（595mm）测量汇丰银行密度，做为MTT法的检查指标。此法的结果与3H-TdR掺入法平行，并能反应试验中的活细胞数（表20-3）。 表20－3 淋巴细胞增殖反应的刺激物 分裂原 T细胞 B细胞 植物血凝素（PHA） + － 刀豆蛋白A（ConA） + － 美洲商陆（PWM） + + 葡萄球菌蛋白A（SPA） ±＊ + 副伤寒杆B（SPB） ± + 注： PWH主要是T细胞分裂原，也可通过刺激T细胞分泌可溶性因子诱导B细胞增殖分化； ＊SPA诱导B细胞分裂不需要T细胞协助，但诱导B细胞激活抗体分泌细胞需要T细胞协助 3．细胞毒试验 TC细胞、NK细胞、LAK细胞、TIL细胞对其靶细胞有直接的细胞毒（杀伤）作用。常用的栓测细胞毒效应的方法是51Cr-Na2Cro4盐水溶液与靶细胞胞混合，于37℃培养1小时左右，51Cr即可进入靶细胞，与胞浆蛋白结合，洗去游离的51Cr后，即可得到51Cr标记的靶细胞，将待检细胞毒性的细胞与51Cr标记的靶细胞混合（比例约为50：1或100：1）靶细胞被杀伤越多，释放到上清液中的液游离的51Cr越多，且不能被其他细胞吸收。用γ射线测量仪检测上清液中的cpm值，即可计算出待检细胞杀伤活性的高低。 细胞毒试验检测Tc细胞效应功能是否健全，及经IgG介导的ADCC效应，或NK细胞在抗肿瘤免疫中的作用是有意义的。 4．混合淋巴细胞的反应（MIR） 是体外研究T细胞的较好的方法，双向MLR常被用来筛选骨髓移植的供体。来自不同供体的淋巴细胞分别与病人的淋巴细胞混合培养4～5天，在最后8小时掺入51TdR掺入法测T细胞的反应性。或用细胞毒法观察受刺激的T细胞与活的靶细胞混合（靶细胞来自与刺激细胞相同的个体）如果T细胞受刺激后产生了细胞毒T细胞，可杀死活的细胞，根据靶细胞释放51Cr的多少算出T细胞移动抑制因子）和LIF（白细胞移动抑制因子）来评估细胞免疫功能。近年来应用测定IL-2的免疫酶技术，操作简单，并能定量以取代了MIF和LIF的测定。单个核细胞与分裂原一起培养24小时，然后测定清液中的IL-2活性。在细胞免疫功能缺损时，特别是AIDS病人，IL-2分泌明显降低。而有些疾病，如多发性硬化、类风湿关节炎、移植排斥反应等病人体内血清中IL-2水平升高，表明病人T细胞活性增高。发生移植排斥反应的病人尿中IL-2也可升高。 也可用酶联免疫吸附试验测定各种体液中活化的T细胞脱落的IL-2受体（CD25），一般来说IL-2的水平和IL-2受体水平是平行的，IL-2和IL-2受体的检测可用于对某些疾病的监测，如移杆排斥、自身免疫病以及接受免疫抑制治疗的病人。 对体外培养的细胞进行细胞因子产生能力检测是检查细胞培养上清液中细胞因子的生物活性或抗原性。现已可用核酸杂交技术，即从组织中或细胞中提取RNA，与同位素或酶标记的该种细胞因子的cDNA探针作分子杂交试验，即印迹（dot blotting）或Northern印迹，若查出有某种因子的mRNA存在，即说明该细胞在所处培养条件下有产生某种细胞因子的能力。

IL-2(Interleukin-2 )是一种白介素，是免疫系统中的一类细胞生长因子，能调控免疫系统中白血球的细胞活性。

实验前应明确的问题

1.选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。

2.药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。

3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。

4.培养时间。200ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。

5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。

6.理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。

7.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。

8.避免血清干扰。用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。

实验步骤

贴壁细胞：

1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。

2.5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况

3.5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

4.每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

5.终止培养，小心吸去孔内培养液。

6.每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）

悬浮细胞：

1）收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 lg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100(储存液100 1640）。

2）置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）

4）离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。

5）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。

MTT的配制

MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。

MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.

配制MTT时用用PBS<ph=7.4>溶解,也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。

PBS配方:

Nacl 8g

Kcl 0.2g

Na2HPO4 1.44g

KH2PO4 0.24g

调ph 7.4

定容1L

关于细胞的接种(铺板)

细胞过了30代以后就不要用了,因为状态不好了;培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。

接种时最好按照预实验摸索出的密度接种, 因为细胞密度在10000/ml左右时，所测得的OD值的区间即细胞抑制率（或者增值率）的所呈现的线性关系最好，结果最可信。如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显，太密细胞可能都会凋亡，因为细胞长的太快营养会不够，最后导致死亡。且而细胞过密或者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳。故而MTT细胞密度多采用10000/ml，100ul/孔。

细胞密度要根据不同细胞的特点来定.如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度，如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度，这样与对照的区别更明显，数据更好。悬浮细胞每孔的细胞数可达到105,贴壁细胞可为103-104.

其它的声音：

1.首先细胞的接种密度一定不能过大，一般每孔1000个左右就够了，我认为宁少勿多。尤其是对于肿瘤细胞。10000/孔是太高了，这样即使药物有作用，MTT方法也是表现不出的，最佳点板浓度在4000-5000/孔，太少的话SD值会很大。

2.MTT本身就是比较粗的实验，增殖率10%左右的波动都不算奇怪。特别是新手，20％的波动也是常见的，所以很可能是技术原因引起的，特别是种板技术一定要过关。

3.我做的是肿瘤细胞的MTT实验,这种细胞长的很快一开始我是用100000/ML的浓度来接种的,结果细胞长的太满结果是没有梯度也没有线性关系.后来调整浓度,用过40000~80000/ML的浓度都做过MTT实验,结果发现做的结果比较好点的是60000~70000/ML的浓度组的.用40000/M的浓度的组,由于细胞少,药物作用的梯度还是有,只是没有很好的线性关系.还有根据细胞生长速度以及药物的特性(有时间依赖性和浓度依赖性的药物)来确定培养时间是48小时还是72小时.

注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。虽然移液器比移液管精确得多，但是如果操作不熟，CV会在8%左右。另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。

首先说说我的一点经验：

1.吹打时悬液总量不能太多，达到吸管吸液量的3到4倍，可能比较容易混匀。10ml的离心管里面最好装3~4ml的悬液：悬液太少容易吹起很多气泡，悬液太多又不容易吹成单细胞悬液。。。

2.吸管的吸液量最好在1ml左右：吸液量过多的话，一下吸起很多液体，管中所剩就很少，这样吹打容易起泡，吸液量过少，吹打的力度就不够，吹打就会不均匀。如果是吸液量1ml多的吸管，总液量在5ml左右为益

3.吸的时候要在悬液底部，然后提起来一点，但是吹下去的时候不要离开液面，否则容易吹打出气泡。

4.吹打次数100左右，就可以吹打均匀了（有人认为加细胞前吹打30－50次基本就差不多均匀了。加细胞的时候每接种2孔反复吹打3次，每吹打3次后枪头垂悬与细胞悬液中5秒钟，然后再以一定的速度吸取悬液。）

5.向每孔中用枪头加入细胞时不要太快，否则你会发现细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周边很少，这种不均匀的分散会产生接触抑制，影响细胞的生长。所以速度不能太快也不能太慢。我习惯每块板加完后平握手中，向左3下，向右3下，在往返回复3下移动，目的是使得细胞能分散的均匀些。（铺板技术是MTT实验的关键，也是基础，一定要练好。曾经有同学用漩涡振荡器混匀细胞，最后细胞全死了，建议不要采用这种方法混匀细胞。

加入MTT

个人认为MTT最关键的是你的细胞数目和你加入真正起作用的的MTT的适当比例，具体细胞数目和真正起作用的的MTT之间的关系确实不好确定，我认为MTT多加一些比少加好一些

MTT的量各家报道不同，一般是过量的，所以10ul即够了。如果不使用96孔板，培养基超过100ul，MTT按照10%的比例加入.加入MTT以后振荡一下让MTT与培养基混匀，不过这个应该关系不大。

如加入MTT后都有个别孔立即变为蓝黑色，则污染的可能性极大,另外MTT稀释后加入细胞前还是需要以过滤的方式灭菌为宜.且在加MTT前可以先在镜下观察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是临近的

因为血清中白蛋白对大部分的药物都有结合效应，所以可以单独将药物和MTT加在一起，看会不会起反应。如果不起反应，就不用去除含药物的培液，直接加MTT即可。

如何清除上清

百家争鸣：

1.加DMSO前要把液体吸掉，但培养液里的紫色结晶可能会吸去，可在这之前先用平板离心机离心96孔板，2000r，5分钟，然后吸掉上清(如果是悬浮细胞，则推荐此法,悬浮细胞要离心2500rpm×10min.且其做MTT最好用圆底型96孔板,清除上清时注意不要把下面的结晶颗粒吸掉,建议各孔吸弃150-160ul即可)。

2.我每次将MTT加入后，再孵育四个小时，然后用离心机离心1000G,5min。但是用枪小心地吸上清，还是会将一小部分蓝色结晶吸出。所以还是建议翻转倒扣的方法吧！

3.另外，可以直接将板翻转倒扣（垫几层滤纸）2－3次，比用“吸”的办法更不容易使细胞脱离出来。可以轻拍，或者倾斜一点帮助吸液，发现紫色结晶几乎没有肉眼可见的掉脱，但前提是你本身细胞贴壁要比较牢，半贴壁生长的细胞容易脱离。假如药物作用时间长的话，阴性对照组可能由于细胞过多而使加入MTT后形成的结晶漂起来，这样就不能直接倒掉上清。

4.做MTT时，这一步骤一定要小心，不要采用倒的方式。因为贴壁不牢的细胞会被倒掉，从而影响OD值。悬浮细胞，不要翻板，离心后也不要翻板，这个方法害死人。

5.加完MTT反应3－4h后，从培养箱取出96孔板的动作要轻柔，避免振荡结晶,使其滑落.你可以试着将96孔板倾斜30度角，然后用枪尖慢慢吸，有的细胞可以用排枪一起吸，有的则要耐心的一个个用枪头吸，枪尖的力度和方向要保证每个孔都一致。不要让枪头接触到孔底，且一旦倾斜孔板后就不要反复倾斜放平，这样也会使结晶脱落。

6.用医用的注射器加上针头吸取液体的，吸取时要把板子斜放，沿着壁吸取就好了！这次MTT我用1ml针头仔细吸培养液,觉得比其它方法可靠,一般不会吸走紫色结晶.

避免清除上清而改进的方法

由于一般可离心96孔板的离心机不好找。既使是贴壁细胞做MTT时，用DMSO溶解得到结果也不好，不是得不到预期结果就是可重复性差。

解决方法1:用以下文献方法：周建军等，评价抗癌物质活性的改良MTT方法，中国医药工业杂志，1993，24（10）：455-457

具体方法：

配三联溶解液：10%SDS，5%异丁醇，0.012mol/LHCL，蒸馏水溶解。

三联溶解液：SDS10g，异丁醇5ml，10M HCl 0.1ml用双蒸水溶解配成100ml溶液

操作：在培养板上加一定密度的细胞悬液，90ul／孔；如需给药，则再于同时(悬浮细胞)或4h后(贴壁细胞)加入不同浓度的药物10ul／孔，均设三复孔。另外，每块板上另没一个调零孔(只加培养液，不含细胞和药物)。培养2d后，加入MTT溶液20ul／孔，继续培养4h，然后加入上述三联液100ul／孔，于37度放置过夜后，用酶标仪测各孔A570值。

优点：简化操作，提高了可靠性。

解决方法2：日本同仁有一种新试剂CCK-8试剂， CCK-8试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST–8[其化学名称为：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲 染料（Formazan dye）。生成的甲 物的数量与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。CCK-8试剂中已预先配入了进行细胞增殖和毒性分析所需的成分，无需再用缓冲液或培养基进行稀释；同时，CCK-8试剂无需任何放射性同位素和有机溶剂。因此，无需特别的技巧，就可使每一位使用者准确、快速地得到重现性好的实验结果。

★优 点

1、简 便 只需一步即可得到结果

2、省 时 毋需预制，即开即用

3、安 全 毋需放射性同位素和有机溶剂

4、快 速 省去了溶解除沉操作

5、灵敏度高 灵敏度高于MTT

6、重现性好 步骤少；无损失；结果准确

就是比较贵，如果经费充足，用这个是不错的。

★进行细胞增殖分析的使用方法:

1、接种细胞悬液100μl于96孔板内，预先置于37℃，5% CO 2饱和湿度培养箱内培养。

2、在每个孔内加入10μl的CCK-8试剂。

3、把培养板放在培养箱内培养1-4小时*。

4、在450nm波长处测定吸光度，参比波长为600nm或600nm以上。

解决方法3：使用MTS

解决方法4：

加入DMSO

在同一批实验中最好不要更换DMSO。加DMSO前把孔中液体尽量弃干净，没有去掉上清直接加DMSO，一是沉淀会很难溶解.二培养液的颜色在检测时也能被测到,会对最后结果造成影响。但前提是不能把细胞也一起吸掉，因为这样带来的误差要远远大于培养液没弃干净带来的误差,所以要在保证细胞不被吸掉的前提下，尽量把培养液吸掉。如果培养液没弃干净，空白孔也要留有等量的培养液，这样在检测时可以尽量去除培养液的影响，DMSO的量也可为100ul或150ul.

1.加了DMSO后用振荡器轻轻振荡5－10min, 时间控制尽量严格一点,放置时间长了会影响结果,值会偏大,且结果不可信.

2.加入DMSO后可用排枪反复抽吸助溶，溶解后尽快检测。如果实验孔不多，建议用此法，因其比振荡溶解效果好。

3.或放入37度放孵箱15分钟溶解结晶。

振荡是为了让甲臜溶解，这样才能更好的测量吸光度，振荡96孔板有专的振荡器，目的:扎破气泡.有气泡存在时,由于其对光的反射与折射作用(酶标仪的原理是通过测定特定波长透过样品的吸光度推测样品内特定物质的浓度),会导致结果偏移.

OD值的测定

至于测定波长的选择是因显色溶液而异的，对于DMSO，溶解后呈紫（红）色，490nm有最大吸收值,而ATCC公司的MTT试剂盒用的不是DMSO，它的测定波长是570。(就如ELISA实验选用OPD作底物测定波长是492，选用TMB显色液则用450);而对于SDS和酸化异丙醇，则选用570nm，并且建议以655nm作为参考波长。

DMSO溶后10分钟内测，越放颜色越深，而SDS做为溶解液测吸收光值，其值可在三天内保持不变.

细胞密度偏大测出的吸光度也会偏大，细胞密度小吸光度也会偏小；另外跟细胞状态也有关系，细胞状态不好的话，吸光度值也会低的；细胞数目少，或者是培养的时间短，OD值也会偏低。如果各个孔的孔间差异性特别明显的话说明有可能存在污染,空白孔的OD值太高，很可能是细菌污染。

复孔直接的OD值差别一般应在0.1－0.15，差别太大考虑：1.接种细胞数不均匀，或是接种太多，应保证每孔一致，一般是每孔1000－10000个。可以细胞细胞计数后，加入细胞悬液，再补培养基到预定体积，并轻轻吹打几次，使细胞均匀分布，这样比直接加入预定体积的细胞悬液要好，接种时应加含血清培养基。2.贴壁时间：18－24h，如果不够，未悬浮的细胞会被吸掉。

一般为了实验的准确，每个浓度可以设5－6个复孔，可以最后统计时，可以除去一个最高值和一个最低值，或者除去其中数据离谱的值，这些离谱数字的出现与细胞是否污染，细胞是否在培养期间死去，是否培养液蒸发过多，加MTT液是否准确，在37℃，5％二氧化碳培养箱中孵育时间是否一定（1－4小时）等有密切的关系，当然测定OD值的仪器工作状态是否正常也非常重要！(一般开机预热20min)。

MTT方法的吸收度在0.2～0.8之间误差较小。这和分析化学中的lambert-beer定律有关， 对朗伯-比尔定律的偏离在吸光光度分析中，经常出现标准曲线不呈直线的情况，特别是当吸光物质浓度较高时，明显地看到通过原点向浓度轴弯曲的现象（吸光度轴弯曲)。这种情况称为偏离朗伯-比尔定律。若在曲线弯曲部分进行定量，将会引起较大的误差。在吸光光度分析中，仪器测量不准确也是误差的主要来源。任何光度计都有一定的测量误差。这些误差可能来源于光源不稳定，实验条件偶然变动，读数不准确等。

在光度计中，透射比的标尺刻度均匀。吸光度标尺刻度不均匀。对于同一仪器，读数的波动对透射比为一定值；而对吸光度读数波动则不再为定值。吸光度越大，读数波动所引起的吸光度误差也越大透射比很小或很大时，浓度测量误差都较大，即光度测量最好选吸光度读数在刻度尺的中间而不落两端。待测溶液的透射比T在15%~65%之间，或使吸光度A在0.2~0.8之间，才能保证测量的相对误差较小。当A=0.434(或透射比T=36.8%)时，测量的相对误差最小。

其它的声音：

1.最好用570nm波长的滤光片，因为MTT在这个波长的吸光度是峰值，换句话说灵敏度高。用其它波长的也有，一般是490nm，但我的经验灵敏度降低一半。

2.我们用的BIO-TEK公司的ELx800,一般值在2以下都是可靠的,如果复孔之间值相差太大就要考虑是否是实验过程中的误差. 我曾经看到园子的有些帖子报道说OD值大概在0.2-1.2范围内与活细胞数有较好的线性关系，但OD值在0.3-0.9范围内可能更佳，若你的OD值不在这个范围内则你实验的细胞数可能不太合适，应调整你的细胞数。

边缘效应

96孔板四周一圈的孔一般只做空白，不养细胞，否则这四行的数据会偏高或偏低,96孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于具有一定的温度，由于温度梯度使得边缘的孔水分蒸发较快，导致培养基中各种成分浓度变化增大，导致细胞状态不同。对于这种现象，要保证培养箱中的湿度，减少开关培养箱的次数和时间。解决方法:将孔板周围的一圈孔全部不用，影响非常大，而且最外一圈一定要加水、PBS或者培养液，只要能防止蒸发就可以.

关于如何计算IC50

(1)改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)

Xm:lg 最大剂量

I:lg(最大剂量/相临剂量)

P:阳性反应率之和

Pm:最大阳性反应率

Pn:最小阳性反应率

举个例子：各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入

计算公式：

Pm=0.95

Pn=0.06

P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1

Xm=lg0.1=-1

lgI=lg0.1/0.01=1

lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025

IC50=0.00025

(2)Bliss法:自己查阅书籍

(3)IC50计算软件，见下面附件

（4）自己用EXCEL做趋势线来求IC50，关于LD50的方法与此相似！

（5）在线求IC50或EC50：http://chiryo.phar.nagoya-cu.ac.jp/javastat/JavaStat-j.htm

结果统计学处理

所有数值以x±s表示，应用SPSS软件进行方差分析，p<0.05时为相差显著，p<0.01时为相差非常显著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求IC50。或计算抑制率。细胞死亡率%=OD对照组-OD实验组/OD对照组

excel表中可以做两两比较的T-test,这个你可以参考一下；你的数据应该用多个样本均数的T-test，方差分析也可。用的软件是SPSS或者SAS。

孔板的重复利用:

培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。一般贴壁生长的细胞用重复利用的培养板效果不是很好，因为培养板表层在生产时涂有一层促进细胞贴壁的物质，在清洗后多半会失去。悬浮或是半悬浮生长的细胞还可以。建议不要用太多次，即使是进口的板子使用次数也不要超过3次,底值最好在测得值的1/3一下。

强烈建议培养板不要重复使用:1、泡酸是可以，但是泡完酸的板子很不利于细胞的生长，会出现帖壁不好，细胞生长缓慢等情况.2、这样的板子消毒灭菌很不彻底，如果有万一,则因小失大.3、重复用的板子洗不干净在培养过程中易出现杂质.

重复利用时

做法1：

洗净后用2％NaoH浸泡4小时，再用1％稀盐酸浸泡4小时，冲洗15遍，蒸馏水冲洗3遍，烘干，UV照射过夜(紫外2小时以上消毒即可)

做法2:

泡酸2－4小时，老师让我们别超过4小时，（普通的玻璃仪器是过夜）。捞出，冲洗干净，烘干后，UV 照射过夜。估计跟其他收集在一起，钴60照射消毒.

做法3:

1.做完MTT后用大水流尽量将板冲净，然后用洗衣粉水泡几个小时（小心最好让洗衣粉先化开）。2.用自来水冲净洗衣粉水，倒扣晾干.3.重铬酸钾加浓硫酸配成的酸液中浸泡过夜泡洗液(六小时以上即可)后自来水洗净（20次左右）每个孔都要处理4.用去离子水冲洗3遍，双蒸水冲洗3遍，烤干5.超净台中紫外线照射2个小时左右，就可以用了，不可以高压。

做法4:

1、测完值的96孔板甩掉孔内培养液，放入超声中超10-30分钟，晾干(或烘干)备用。

此步骤可最大程度的洗去污垢及细胞。

2、每孔加入50-100ul的胰酶(0.05%)，我一般加60ul，加完胰酶后水平振荡96孔板以使胰酶均匀覆盖于细胞表面，室温下放置至细胞被消化脱落为止。假如你想消化快一点的话可将96孔板放到37度培养箱内(胰酶在37度时的活力最大)。

对于顽固贴附在壁上的细胞，此步骤最为有效。

3、甩掉胰酶，自来水下冲洗，晾干(或烘干)备用。

如果不烘干就泡酸，那么96孔板残留的水分将稀释酸液，长期以往泡酸的效果下降。

4、将晾干的96孔板泡酸(中强酸)过夜，捞起后自来水下冲洗10遍；双蒸水冲洗3遍。三蒸水冲洗3遍。烘干备用。泡酸时特别注意时间不要太长了，否则板子变黄，影响最后的OD值的测定。

5、做实验前，96孔板至少在紫外灯下照射30分钟，但不能长期照射。紫外线长期照射可使板变黄，我的两块板放在超静台上忘了拿出来，一直照了两个星期，等我从超静台上取出板已经变成黄色。

注：

1、在实验中若你测得某一个孔的数值偏高，虽然有很多因素会导致数值偏高，但是如果是板底的污点引起的话你可以消除。拿出96孔板擦一擦值偏大孔的板底部，再测值。你会发现孔高的值又会到正常水平。因为咱们做实验时手不可避免的接触96孔板板底留下痕迹，这些痕迹就会使吸光度升高。

2、96孔板洗的次数多了，板底自然留下划痕，这就会导致读数的不均而影响实验结果。你不妨在做实验前测一次96孔板的值(此值为初值)，实验测得的为后值。后值减去初值就接近实验的真实值。

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