bd流式细胞仪c6 fitc/pe/apc哪个通道
作者&投稿：席盼 （若有异议请与网页底部的电邮联系）
这个不需要记忆的。每个荧光染料都有自己对应的激发激光和最强的释放荧光光谱。这个可以在网上查到，比如这个网页：
https://www.bdbiosciences.com/sg/research/multicolor/spectrum_viewer/index.jsp
或者
https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html
你可以在网页上找到你所问的这四种荧光素的光谱。
然后，在你机器的设置参数里面，你可以看到每个激光所对应的FL的数字，已经那个通道所对应的波长，一般都是标注为XXX/XX。这个就是说该通道的检测波长是XXX，范围是XX纳米，以XXX纳米为中心。
你理解了这些，以后再遇到其他的荧光素，其他的机器型号，也就能得心应手了。很多机器都不再使用FL这个名字了。而是有其他的名称。
流式细胞仪（Flow cytometry ）是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是说，它的细节 分辨率为零。
流式细胞仪数据分析
5.1 数据采集及显示
光信号转换成电压脉冲后，再通过模数转换器转换成为计算机能够储存处理的数字信号。 流式细胞仪的数据以FSC标准格式存储，该标准由“分析细胞学协会”制定。
根据FSC标准，数据存储格式应包括三个文件：样本获取文件，数据设置文件和数据分析结果。 4参数（FSC,SSC,FITC和PE）的单细胞分析会生成8位数据。当单个样品累计收集到10000个细胞时，FCS数据文件为80kB.
数据采集存储完毕后，细胞亚群可以几种不同格式显示。单参数如FSC或FITC（FL1）可使用直方图，横轴表示荧光通道。纵轴表示在该通道内收集到的细胞数量（如图5-1）。处在同一通道的每一细胞均符合该通道的信号值，而且具有相同的信号密度。通道右侧信号的荧光强度明显高于左侧，越靠右侧荧光亮度越强。 图5-1 流式数据分析图
双参数可在二维散点图中同时显示，X轴显示通道1（FL1），Y轴显示通道2（FL2）。3维图通过X,Y,Z三个轴分别显示每个通道的细胞量（如图5-1）。
习题：数据采集及显示
1 在直方图中横轴和纵轴分别表示 .
2 二维点图用于显示 参数。
3 在CellQuest软件中3维图中Z轴代表 .
5.2 设门
通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。如：血样本是混合细胞群，如果想单独分析淋巴球细胞，可根据FSC或细胞大小，在FSC,SSC的散点图中设门，其数据结果只反映淋巴细胞亚群的荧光特性。 图5-2 全血样本中淋巴细胞亚群的数据分析图
习题：设门
1 设门的方法通常用于分析样本内的指定细胞。（对 错）
5.3 细胞亚群的数据分析
数据分析包括从点图中的list-mode文件中显示数据，然后统计点图中的细胞分布情况。如前所述，分别有几种形式的点图用于显示数据，而且可通过设门的方法区分指定的细胞亚群。 如图5-3所示，在淋巴细胞亚群周围设门，以单独分析或分选该亚群细胞。
图5-3 选定淋巴细胞亚群设门
门内细胞的数据结果可在随后的图中显示。在下面的实例中，我们将详尽阐述细胞亚群百分含量的不同分析方法。 我们可以通过单参数直方图，二维点图和三维图来分析结果。单参数直方图可定位边界，二维点图可设置象限标志。如果需要，还可以建立数据统计表以输出结果。 直方图可直观单个参数的细胞数量。阴性对照用于决定直方图中单参数的左右边界（见图5-4）。左图中M1为阴性对照峰。右图中M2为CD3 FITC阳性峰。
图5-4 阴性对照峰M1（NORM001）和CD3 FITC阳性峰M2（NORM002） 图5-5的统计结果表明，整个事件共记录了6000个细胞，门内淋巴细胞2891个。其中M1（阴性）细胞619个，M2（CD3阳性）细胞2272个细胞。淋巴细胞亚群CD3阳性百分含量的统计结果为：M2：2272/2891=78.59%.
图5-5 直方图统计结果
二维点图以双参数显示结果，每个点表示一个或多个细胞。图5-6为阴性对照图，用于设定阴性对照边界，全图划分为四个象限，以区分阴性细胞、单阳性细胞以及双阳性细胞。左下象限（LL）为双阴性细胞，左上象限（UL）为Y轴阳性细胞（CD19 PE），左下象限（LR）为X轴阳性细胞（CD3 FITC），右上象限（UR）为双阳性细胞（CD19+/CD3+）。
图5-6 阴性对照组（NORM001）和CD3 FITC/CD19 PE双染样本（NORM002） 如图5-7所示，淋巴细胞亚群双阳性细胞（CD19+/CD3+）的百分含量为：296/2839=10.43%.
图5-7 散点图统计结果 另一个分析方法是划定区域，也就是设门。我们可以用不同形状的绘图工具定义所选区域（如图5-8所示）；然后统计该区域内指定细胞亚群的百分含量。在图5-9中，R4门内为CD4阳性，CD3阴性的淋巴细胞亚群，其结果为：40/2866=1.40%.
图5-8 CD3 FITC/CD4 PE 双染样本分析图 图5-9 CD3 FITC/CD4 PE 双染样本数据统计结果
这种方法在分析不同的供体细胞时存在一个缺陷，因为如果事先定义好细胞亚群的区域或边界，在随后的文件中，下一个样本的细胞亚群位置会发生变化，这就需要操作者重新调整区域或边界位置。 为避免这种情况的发生，我们采用一种称为集群分析（cluster analysis）的新方法。BD公司的MultiSETTM 和AttractorsTM软件就属于集群分析软件。该软件的特点是会随着整个细胞亚群的移动而移动，自动变换区域或边界到相应的细胞亚群位置（见图5-10）。
图5-10 使用Attractors分析软件时二维点图的前后变化对比
5.4 流式细胞仪的其它应用以及数据分析
这些分析方法通常适用于计算离散细胞群的百分含量，对于分析单克隆细胞株分子是否呈阳性并不适用。因为单克隆细胞株是单个细胞群，在大多数情况下，既不是100%阴性，也不是100%阳性，所以我们通过几何均值法和中位法统计细胞荧光密度和阳性率。如果样本的统计结果远远大于阴性对照组，那么我们认为其结果是阳性的，两者间的差异越大，说明细胞的表达越高，阳性率越高。 如图5-11所示，左图为单细胞群的散射光信号，右图为阴性对照组和两种不同抗体染色样本的峰叠加图。每个峰的几何均值分别为2,5和20（从左至右）。
图5-11 单细胞株分析图 除检测阳性率，几何均值法和中位法还用于分子（接合子）定量分析。
QuantiCALCTM软件就是使用中值法计算每个细胞的抗体结合位点数。如图5-12所示，Y轴上的圆圈代表从标准曲线获取的信息，用于计算每个细胞的接合点位数。 图5-12 使用QuantiCALC软件计算每个细胞的抗体结合位点数 我们使用ModFit LTTM软件进行DNA定量分析。因为DNA峰（G0/G1期，S期和G2M期）不是离散的，所以我们对曲线以下的面积进行积分，以得到每个细胞亚群的百分含量结果。
图5-13 细胞周期的DNA直方图
习题：数据分析
1二维点图和一维直方图的作用分别是什么？
2 见图5-4和图5-5,CD3阴性和阳性的百分含量分别是多少。
3 LL象限代表双阳性细胞亚群。（对 错）
4 见图5-6和图5-7,淋巴细胞（CD3+/CD19-）的百分含量是多少。
5 只能使用矩形设定细胞区域范围。（对 错）
6 使用区域设定法分析样本有哪些不足。
7 避免细胞亚群移动的分析方法是什么。
8 在定量分析中我们使用哪些分析方法检测阳性率。
5.5 CellQuest和CellQuest Pro软件使用
CellQuest和CellQuest Pro软件是目前运用最为广泛的流式细胞仪采集及分析软件。它运行于苹果电脑上，优质的矢量图显示使得操作界面特别优美。现最新的微软公司的Vista软件也是仿苹果操作系统界面的，可想而知在使用CellQuest和CellQuest Pro时的强大功能及视觉质感。CellQuest和CellQuest Pro软件主安装在BD FACSCalibur型流式细胞仪上。
1.软件数据流程
在CellQuest和CellQuest Pro软件的数据流分为二个部分：方案和数据包。方案是指用户可以建立采集或分析所需的直方图或散点图、设门并定义门与门、门与图之间的逻辑关系。可以使用方案进行数据采集或分析以往已有的数据。每个采集方案分析样本后会生成数据包，该数据包中包括了样本中每个颗粒在各个检测参数上的数值，格式为FCS2.0或FCS3.0.
数据包必须由方案文件打开，无法单独显示，或者可由第三方软件进行分析，如WinMDI.
2.软件与仪器的连接
流式细胞仪需要加电开启后会向计算机发出信息，所以如要进行实验需要先开启流式细胞仪，然后再开启计算机。
1、\x09先开仪器后开计算机，以确保仪器和计算机之间的正常通讯。
2、\x09在苹果菜单下点击CellQuest和CellQuest Pro软件。
3、\x09从Aquire菜单下选择connet to cytometer.
3.方案与数据之间的关系
CellQuest和CellQuest Pro软件的方案与数据相互独立保存，数据包可以由任一方案文件进行分析，分析后不改变数据包中的任何数据。CellQuest和CellQuest Pro软件中方案内的直方图或散点图有三种状态：Acquire,Analysis和Acquire-Analysis.
当图的属性为Acquire时，此图只限于采集下用，即只当进行检测时它才能显示颗粒；
当图的属性为Analysis时，此图只限于分析已保存的数据包，它不能用于采集数据。
当图的属性为Acquire-Analysis时，此图即可用于采集数据也可用于分析已有数据。
所以方便起见，我们一般将方案中的直方图或散点图全部设为Acquire-Analysis属性。
CellQuest Pro CellQuest
4.方案的建立
A选择实验参数
默认情况下，FACSCalibur流式细胞仪开机后只打开一根激光器，及五个参数供选择使用：FS、SS、FL1、FL2、FL3.当我们要使用第二根激光器及FL4通道时需要勾选FL4的选项，仪器自动打开633nm激光器。
B,建立散点图或直方图，命名坐标
CellQuest Pro软件主要工作界面，软件类似于Office word的工作面，可在A4大小的页面上进行编辑建立各种直方图或散点图。
在CellQuest软件下，需在选择Plot菜单，选择Format来打开图的属性对话框，其中包括了关于该图所有选项。
建立好直方图或散点图后，我们需要对所选的参数进行命名，如不修改软件自动命名为FS、SS、FL1、FL2、FL3和FL4.
在菜单上选择Acquire栏目，选择Parameter Description,可出现关于文件存储和参数命名的对话框。在这个对话框中用P字母来代表每个参数，并在此对每个采集参数进行命名，FL1为CD3FITC,FL2为CD4PE……
C,设门并建立门与图之间的关系
R与G的关系
R是Region的首个字母，Region一般是指一个闭合形的区域，如矩形区、自由区和圆形区。区域与区域之间可以进行逻辑运算，如AND、OR、NOT等关系。当区域进行运算时软件引进了算术公式的管理概念：
Gate实际了个代数式，简称G,其运算式默认如下：
G1 = R1,或G2=R2
当我们要进行逻辑运算时，可变更为G1=R1 AND R2.此时G1就成了一个算术结果了。
G1=R1 AND R2
G2=R1 NOT R2
G3=R1 OR R2
Region List管理门，可以重命名或删除门。Gate List是对门进行逻辑运算和标识颜色的工具。
建立门与图之间的关系
打开要编辑的直方图或散点图的属性对话框，选择Gate选项，选择门即可。
D,显示统计参数
5.仪器的操作
当计算机与流式细胞仪联机后便会出现以下采集控制框：
在有关仪器操作所有控制选项框都在Cytometer下拉菜单下，同时按住“苹果”键及1、2、3、4便可调取所有控制框：
6.文件的保存及调用
实验或分析过程中所建的方案可以保存下来，通File下拉菜单可以保存这些方案文件：
如要打开这些分析方案只需双建方案图标即可；方案可以分析以往的数据包（前提是方案中的直方图或散点图都已定义成Acquire-Analysis属性），有两种方案打开以往的数据：
方法一：选择直方图或散点图，打开该图的属性框（Plot-》Format），见下图：
在以上红色框标注的地方选择要分析的数据包。
方法二：选中方案中所有的直方图或散点图，打开Plots菜单，选择Chang Data File,打开要分析的数据包。
娄楠赛乐： 要看你是什么染料标记了 例如临床上,最常用的荧光染料主要有三大种: FITC、PE和PeCy5.肉眼观察,FITC为绿色;PE为橙色; PeCy5为红色.它们都在488纳米被激发.检测波长分别是:FITC是525纳米;PE是575纳米;PeCy5是675纳...
巫山县17622825867： 流式细胞仪 bd c6 怎么样 - ？
娄楠赛乐： 这个机器优点是比较小,使用也方便 缺点也很多.激光的功率很小,对荧光信号的灵敏度和分辨率都很差.只有很强的信号才适合于在这个机器上使用.如果经常要改变染色的步骤,使用不同的样本,或者抗原的量不确定,不建议用这个机器.
巫山县17622825867： 如何用FlowJo分析Accuri C6数据 - ？
娄楠赛乐： 目前市场有很多流式仪器,包括几家大的公司如BD,贝克曼等.FlowJo做为一款优秀的流式数据分析软件,可以兼容几乎所有流式仪器采集的数据,可以弥补其它机器自带软件的分析功能不足的缺憾,这也是FlowJo备受欢迎及推崇的原因.今...
巫山县17622825867： BD推出新型流式细胞仪怎么样,那里能了解生物方面的最新资讯？
娄楠赛乐： 全球流式细胞仪巨头BD生物科学公司最近推出了BD FACSVerse™流式细胞仪.这款流式细胞仪目前有4色、6色和8色配置,带有前向角散射和侧向角散射,支持最多10个参数.4色和6色系统可通过升级而扩展.该系统体积小巧,能够轻松安...
巫山县17622825867： 请问流式细胞仪是否可以检测被放射性同位素标记的物质? - ？
娄楠赛乐： 流式细胞仪不是ECT,他只能识别不同的荧光,一般有四个荧光通道FL1-FITC,FL2-PE,FL3和FL4的激光不同厂家可能不同(主要是BD和BECMAN),所以只要是悬浮的颗粒,只要可以标记上荧光,都可以检测.有商品化的抗体,很多,比如anti-human HER-2 FITC 是Bender公司的.你要是想重复别人的试验,最好找到原始文献,买和文献一个厂家,同一批号的抗体.
巫山县17622825867： 流式细胞仪检测树突细胞的表面标记应注意什么问题 - ？
娄楠赛乐： 千万不是空白对照,而是isotype对照. 比如你用的CD1a-FITC(如果是鼠单抗IgG1,那对照抗体就要用相同物种的非特异性IgG1-FITC).注意浓度要相同.一般提供抗体的公司BD,santa cruz等有提供的.其他就按照说明书的推荐浓度和孵育时间.
巫山县17622825867： 如何用流式细胞仪检测GFP的表达 - ？
娄楠赛乐： 一般流式细胞仪都有FITC通道,GFP可以用该通道来测量.用同一细胞系的转染了无GFP质粒的细胞做阴性对照,设置阈值.
巫山县17622825867： 最好的流式细胞仪是哪个公司生产?？
娄楠赛乐： 2个公司几乎垄断了流式细胞仪.一个是BD. 还有一个是Beckman Coulter,要是做分析的话两家都差不多,要是做分选的话就选BD的aria 2/3,贝克曼的分选MOFLO价格太贵了,而且因为其太过于专业,分选操作没有BD的方便快捷.
巫山县17622825867： 流式细胞仪 白细胞中各细胞类型分离 - ？
娄楠赛乐： 如果要求不是太严格的话,增加两种荧光抗体即可,也就是说得同时标记4种分子.1、抗CD3荧光抗体.CD3为TCR成分之一,表达于T细胞.流式细胞分析时,CD3阳性细胞群即为T细胞群.2、抗CD19或抗CD20荧光抗体.CD19表达于B细胞和滤泡树突状细胞,如果样本不是淋巴结等免疫器官,用CD19抗体就能够代表B细胞群了.CD20表达于B细胞群,不表达于浆细胞.要分析你感兴趣的两种分子在B细胞的表达情况,选择CD19或CD20阳性细胞进行进一步分析即可.CD3、CD20双阴性的细胞即为其他细胞.
巫山县17622825867： bd十色流式细胞仪都有什么型号 - ？
娄楠赛乐： 只要能配置3种以上激光的仪器都可以测10色.这个和型号的关系不大,除了某些型号只能配置2种激光外,其他机器都可以.但是要看买的时候是否都配齐了.比如LSRII,可以配4种激光,可以检测14种颜色.但是如果买的时候只配了2个激光,型号还是LSRII,但是就不能检测10色了.
