怎么样在CA中筛选出包含一特定结构的新物质

在H;O;C;S;Ca五种元素中，选择适当的元素，组成含有3种或3种以上元素的物质~

H2SO4 H2SO3 H2CO3 CaCO3 Ca（OH）2 Ca（HCO3）2 CaSO3 CaSO4

碳酸钙 CaCO3 【大理石 石灰石的主要成分】 氢氧化钙 Ca（OH）2 【石灰 刷墙粉。。。】

摘要：大肠杆菌可以应用介电电泳从含有人血细胞的混合物中分离出来，然后在一个微构造生物电子芯片上通过蛋白水解消化电子溶解。铂微电极利用交流电场分离细菌至25个微位置，这些位置上每个都有一个附加的铂微电极，电极直径是80μM，相邻电极中心间的距离是200μM。细菌分离后用一系列高电压脉冲溶解，溶解产物包括有一系列的RNA、质粒DNA和基因组DNA。溶解产物进一步在另一个生物电子芯片上用电来提高杂交进行检测分析。介电电泳分离细胞后，然后在一个电子活跃的芯片上进行的电子溶解和消化，这种方法可能作为样品的分离在一个完整的DNA/RNA分析系统中，作为用于芯片杂交分析的样品制备过程中可能很有潜力。

用于生物分析特别是用于DNA杂交的微型生物芯片，包括样品的制备及检测的整套系统中具有很大的潜力。这样的一个系统中的第一部分的结束即样品的制备，在整个过程中证实是最难整合的部分。

目前已经开发了好几种分离细胞的方法。微小的硅玻璃滤过芯片可用来从人全血细胞中分离白细胞，通过加热可以从这些分离的白细胞中提纯溶解产物，这些产物可直接在同一张芯片上进行PCR扩增。已有人做过用在硅片的基质上刻蚀着许多微电极的微构造机械筛床通过电脉进行细胞分析。细胞的运输是通过电渗和电泳泵完成的，随后在在微构造上进行细胞的化学溶解。此外，在所有用芯片进行细胞分离的技术中，介电电脉法分离细胞是应用最广泛的方法之一。极化颗粒包括那些没有净电荷的粒子，在非均一的电场中受到电泳牵引力的作用，其条件是这些颗粒有效的极化作用与周围介质的有效极化作用是不同的。不同细胞类型移动的方向决定于（1）与表面电荷相关的电子双层外膜（2）细胞膜或细胞壁的传导性和介电常数（3）形态和结构。介电电脉已用于分离那些携带活的或无活性的人群、革兰氏阳性和阴性菌、病毒和癌细胞。

我们报道在一个微构造芯片上，根据提取的RNA 和DNA的电子扩增杂交这一电子样品制备过程的进展。样品制备过程始于从血细胞中分离大肠杆菌，该过程通过在一个覆盖有25 个特定位置的微电极的矩阵的一个硅芯片上介电电脉进行的。被分离的细菌在血细胞被洗脱后依然存在于电极上。原核细胞通过这种方法进行分离，然后通过提供一系列高电压脉冲进行电溶解，提取出一系列的核酸。提取的RNA和DNA然后运用生物芯片进行分析。

结果

从血细胞中介电电泳分离大肠杆菌、分离的大肠杆菌电子溶解、用蛋白酶K消化蛋白质都在一个流动池中一张微生物电子芯片上完成。为了提供介电电泳的交流电场，尝试两种不同确定位置的模式。图1表示5×5电极矩阵的square-wall和checkerboard两种方案的图解和对应的从交流电场（10KHz正弦波，相邻峰至峰10V）计算而来的对应的计算机模型。在square-wall模式中位置的确定,相同方框中的电极与相邻的最近的框中的电极有相反偏电压。Checkerboard模式中，每一个电极与相邻的最近的电极有相反的偏压。这个电场分布模型表明一个电场的有规律分布能够应用用Checkerboard定位模式得到，但是这种模式应具有在电极和电极周围的最大值之间的整个范围内的确定范围的最小值。相反，这种模型也表明，虽然区域的最大值固定在电极上，但是square-wall模式产生的区域最小值被播散。

图1：（A）和（B）分别为两个5×5的电极的定位Square-wall格式和checkerboard 格式；（C）和（D）分别为交流电场分布的相应的计算机模式，颜色从红、橘红、橘色、黄色、绿色和兰色分别代表从最高到最低的电场梯度。

图2. （A）和（B）分别为经过预打湿的Square-wall和checkerboard经过覆盖的芯片；（C）和（D）为两种定位格式的分离结果（电场最大区域为白色阴影区，电场最小区域为红色阴影区）；（E）和（F）是两种格式经过完全的清洗过程。

图3. 通过电解得到的大肠杆菌的核酸的琼脂糖分析。1为λDNA Hind III 酶解的标记；6为ΦX174 Hae III 酶解的标记；2为超螺旋的pCR2.1质粒；3为线性的pCR2.1质粒；4为经过RNase酶解的电解液；5为未经RNase酶解的电解液。

图4 从大肠杆菌的电子溶解液中提取的质粒DNA的杂交。电极模式依据X-Y轴的格式进行设计的，X轴是从上开始，Y轴是从左开始。（A）在5-5位置电极上的是用来证明捕捉探针的黏附性及电子杂交的特异性的合成的寡核苷酸RCA5，被与之互补的探针ATA5被定位于5-5点，与之不互补的探针被定位于5-4点，在4-5点没有探针。（B）以下点为合成的对照靶标的杂交 点1-5为互补的探针；点1-4为非互补的探针；点。点3-1为大肠杆菌基因组DNA溶解液对照的电子杂交，点3-5为没有插入片段的质粒DNA溶解液对照的电子杂交。3-2和3-4分别为具有与插入片段互补的探针；在以下点表明具有插入片段的质粒的不同稀释浓度的杂交：5倍稀释，点1-1，1-3，2-1和2-3为具有互补探针的点，点1-2和2-2为具有非互补探针的点；3倍稀释，点4-1；4-3，5-1和5-3为具有互补探针的点，点4-2和4-4点为非互补探针的点。

图5 应用电子溶解从大肠杆菌中提取的RNA的杂交结果。合成的对照靶标RCA5被电子定位于点1-5和1-4，1-5上具有互补的探针，1-4上具有非互补的探针。溶液被定位于在1和3列上，这些点没有进行严谨性过程的杂交，点1-1和点1-3为3倍稀释的材料，点2-1，2-3，3-1和3-3为5倍稀释的材料。（B）为应用电子严谨性包含RNA的溶解物的夹心杂交的结果。列1和列2 应用负偏压去掉没有杂交的核酸；在列1中的点包含有特异性探针，在列2中的点含有非特异性的点。列3是没有经过副偏压提高严谨性的特异性杂交的结果。

在采用介电电脉从血中分离大肠杆菌之前，用分离缓冲液冲洗芯片，把渗透膜打湿，并且去除任何水泡。在实验开始时，用预洗过的square-wall式（Fig.2A），电极表面出现黑色，在细胞混合物被引导到流动细胞后分离近4分钟结束。分离的结果（Fig.2C）与区域分离模型（Fig.1C）比配。大肠杆菌占据电极的整个区域（电极上的白色阴影部分对应最大区域），血细胞在电极之间（红色阴影、V型部分对应最小区域）聚集。然后，用分离缓冲液冲掉在电极之间的最小区域松散聚集的血细胞。在冲洗过程中，因为交流场持续存在，分离后的大肠杆菌依然在电极的最大区域上。冲洗完成后，分离的大肠杆菌在所有25电极上（Fig.2E）显示为白色阴影部分。

也可以用checkerboard模式（Fig.2B），在细胞混合物被引导到流动细胞后近4分钟分离结束，分离的结果（Fig.2D）与区域分布模型(Fig.1D)相匹配，电极上的白色阴影部分表示保留的细菌细胞的所在地，红色阴影部分表示在最小极聚集的红细胞和白细胞的混合物，在冲洗阶段将聚集在最小极的血细胞去除。单个大肠杆菌与红细胞不能被溶解有2个原因（Fig.2D），首先这些细胞相对于电极的直径（80μm）来说非常小（<5μm）；其次因为通过介电电脉分离的细胞是个被称作“珍珠链”的三维形式存在，用我们的装置来使所有的细胞聚集是很困难的。

电溶解是应用在四个相反电极和25个更小的细胞聚集电极之间一系列脉冲（500V400脉冲带每20脉冲交替的电极脉宽50μs）进行的。为了使冲洗缓冲液中的蛋白酶K能够消化污染的核酸蛋白质，芯片上的溶解混合物在50℃下培养20分钟。琼脂凝胶电泳(Fig.3)结果表明质粒、基因组RNA和DNA二者都能从细胞中提取出来，基本上对核酸无明显损害的。通过比较经过RNase A处理和没处理的溶解产物来确定RNA带。溶液经过RNase A消化后，所有小于1078bp的带都消失，也就是说这些带由RNA组成。同时，提取的质粒DNA保持超螺旋（无刻蚀）形式，与所买的超螺旋质粒相比较具有相同分子量。

对于杂交，消化溶解产物从细胞分离芯片上移出，用杂交缓冲液稀释3倍和5倍，并加热使其变质。然后将稀释过的溶解产物转移至分析芯片上，这些分析芯片表面覆盖着链亲和素琼脂糖，并通过电定位在电极的特殊微位置上定位生物素捕捉探针。这些捕捉探针包括与插入在质粒中的片段互补的寡核苷酸，这一片段是沙门氏杆菌的Spa0区域来的296碱基，与之互补的寡核苷酸探RCA5来自人的DQα基因，这些靶序列，包括溶解产物和与捕获探针互补的含SpaO区域序列的模式靶样寡核苷酸，通过一个夹心杂交过程进行检测。在这个检测过程，目的DNA/RNA首先与固定的捕捉探针进行杂交，然后被第二个探针进行结合，逐渐显现出结果（第二个探针为含荧光团报告分子或标记探针）。

为了进行杂交，每个靶序列都是通过电子定位在分开的带互补和非互补探针的微位置上（Fig.4），作为一个正对照，合成的靶样RCA5带有一个荧光集团，首先被固定在有互补和非互补探针的微位置上，化学固定和杂交工作如预期所想的。此外，在SpaO区域的固定着模式靶样寡核苷酸探针的微位置上的信号水平几乎是含非互补探针的微位置上的信号水平的2倍高。下一步，用RNase-A已消化了的含插入SpaO质粒和基因组的溶解产物被定位和杂交在选出的具有互补和非互补探针的微位置上。来自3倍和5倍稀释的溶解产物与互补探针信号水平比非互补探针上的信号水平强4倍和2倍，这也证明杂交的特异性。作为一个附加的负对照，一个没有嵌入Spa0质粒的溶解产物与不同微位置的相同探针进行杂交。如预期的那样，在互补和非互补探针位置上的信号水平都低。

用RNase A处理溶解产物的杂交结果和对照结果表明电溶解产物经过加热变质的质粒DNA能直接用于杂交分析。从稀释3倍的溶解产物得到的信号水平与从模式靶样寡核苷核得到的信号水平相当。

用没有用RNaseA处理的溶解产物做相似的的杂交实验。模式靶样寡核苷酸作为一个正对照，可以看到一个特殊的电子杂交（Fig.5A）。包含RNA的溶解产物在杂交缓冲液中稀释3倍或5倍，在特殊的微位置上进行电固定和杂交。为了提高杂交至溶解产物的16S核糖RNA的特异性，还试着用电来改进缺点，在互补探针的信号水平至少比非互补探针信号水平强4倍（Fig.5B），固定在捕获探针上的模式靶样寡核苷酸的信号水平几乎是非互补探针信号水平的2倍。从电子溶解产物来的经过加热处理的核糖体RNAs被直接用于杂交分析，同时包括一个严谨的洗涤过程。从稀释3倍的溶解产物得到的杂交信号水平能够与特异性寡核苷酸靶得到信号是相当的（Fig.5B）。

讨论

从人血细胞中分离大肠杆菌是应用生物电芯片来完成的，这种芯片最初的设计是用来应用电子学来提高杂交分析的。从理论模拟和实验结果表明用checkerboard定位模式应用介电电泳分离大肠杆菌，比用square-wall定位模式（即从最小极至最大极）产生的分离效果更好。在应用的区域进行明显的分离，更容易洗去不想要的细胞。虽然用于该研究的芯片只有25个电极，但应用这种方法分离大肠杆菌用于质粒DNA和RNA杂交分析已经足够了。通过用一个带已提高密度的微电极的矩阵，在很短的时间内就能获得想要细胞的高覆盖区域。

芯片表面覆盖着一层琼脂糖渗透膜。这层膜能够降低细胞的粘合力，由于这层膜的电场处于最小值，因此很容易将不想要的细胞洗去。这些分离的细胞也与金属电极有一定的距离，因此被电极表面上发生的电化学所破坏的可能性很小。为了捕获细胞的特殊类型，琼脂糖膜能够提供一个化学附着物的功能。例如，链球菌能被共价结合到琼脂糖上，因此链球菌能够用来固定生物素标记细胞特异性单克隆抗体。

带有RNA靶样的非特异性背景荧光较强。严谨的电子冲洗在产生非特异性信号方面，甚至在很低的电条件下都有效，这表明如果在那些必须检测多拷贝的质粒DNA的实验中，可以用直接信号检测，不再需要用酶增殖法。

我们所选大肠杆菌和血细胞的混合物是个随机的模型，我们也分离了溶血性链球菌（Micrococcus lysodeikticus）、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和培养的来自血细胞的子宫颈癌细胞。这些细胞和其他细菌从混合物中的分离，表明电分离方法在医学诊断、食物检测、水质监测和其他领域中的应用有很大的潜力，通过电休克得到的从细菌提取的溶解产物包含一系列核酸其中除了琼脂糖凝胶电脉能发现的最小的剪切物以外，还有RNA、超螺旋质粒DNA和没有降级的高分子量的基因组DNA。用提取的质粒和RNA可获得特殊的杂交信号。用基因芯片研究基因表达已经引起了很大的重视，用基因芯片进行RNA的杂交在检测基因表达方面很有潜力。这里所用的方法可能证明在基因表达研究上很有价值，这个研究价值就在于它能从大量其他细胞中分离一些特殊类型的数量极少的细胞，用于一些特殊亚种群的RNA的研究。

虽然细胞分离和溶菌是在一张芯片上完成的，但是加热变性和分裂以及杂交是在另一张芯片上。我们预测将来两张芯片和所有过程（包括核酸在芯片上的扩增）能在一个简单的盒子里。

实验操作步骤

正如描述的那样完成生物电子芯片的构造和增厚。

生物电子芯片的微构造：带5×5铂微电极的硅芯片是由标准的半导体技术加工成的，相邻电极中心至中心的距离是200μm，每个电极的直径为80μm，热处理的氧化硅上喷上一层厚度为100nm的钛－钨层，然后再覆盖300 nm厚的铂层。金属的图形由光刻印刷技术与王水湿性方法完成。在此金属图形上通过原浆扩增和化学蒸发沉积低密度氮化硅（1.3μm）和氧化硅（100nm）的薄膜。在通过光刻印刷技术和等离子体刻蚀法被刻蚀至微电极上。将芯片线焊至印刷电路板上，制成一个含符合个人电脑内存卡国际组织标准的有个人电脑卡的芯片。

渗透膜离心覆盖至芯片上：用异丙醇冲洗然后用去离子水洗涤芯片，再在氮气流中吹干。胶卷(cartridge)承担着将这个干燥芯片垂直地置于原浆清洁船中，用氩（250mtorr，250w）清洁5分钟。

谷胱苷肽琼脂糖（Sigma，St.Louis，MO）A.2.5％基质渗透膜（BPL）溶液如下准备，谷胱苷肽琼脂糖（250mg）加入去离子蒸馏水中（10ml），混合，然后煮沸8分钟，完全分离的琼脂糖溶液预热（65℃），微量离心管用1.2μm孔径的洗涤过滤器，过滤的琼脂糖溶液在65℃中平衡5分钟。上层渗透膜包含固定的允许生物素探针附着物以链霉亲和素-生物素交互作用为媒介的链霉亲和素，如下制备，通过一个含氯化钠（250mM）和磷酸钠（10mM，PH7.2）的溶液保留链霉亲和素（Boehringer Mannheim, Indianapolis,IN），得到链霉亲和素溶液。这个链霉亲和素溶液与温度平衡溶液BPL结合产生2％琼脂糖和1mg/ml的链霉亲和素。这个温暖的BPL溶液（50ml）被放至每张芯片上，并且在室温下用离心机（EC101D，Headway Research，Garlan，TX）在2500rpm离心20秒。在BPL凝固后，上层温暖的渗透膜溶液（50μl）被放置在BPL的最上层，并且在室温下用10,000rpm离心机离心20秒。然后这芯片在37℃中培养30分钟。为了在谷胱苷肽琼脂糖和链霉亲和素胺之间得到Schiff基质联接，新鲜制备的硼氢化氰钠（sodium cyanoborohyidre）（0.2M）/硼酸钠（0.3M），PH9.0用芯片在常温培养1小时，剩下的乙醛组在硼酸钠（0.3M），PH9.0，常温下30分钟，浸入甘氨酸缓冲液(0.2M)中，芯片最后用去离子水冲洗5分钟，干燥4h然后储藏在4℃的环境中。

芯片的胶片装备：一个碳酸酯模型流动细胞用紫外线胶合法（Norland 68，Thorlabs，New Brunswick，NJ），即200W紫外线照射45秒（4joules/cm2），被胶合在芯片上。然后滑动的盖板依上述的程序被胶合至上层的流动细胞上，形成一个密封室，带瓶颈塞的塑料管被嵌入流入和流出的流动细胞，然后胶合至上述的部位。流动细胞的最后容量约7.5μl，从渗透膜至最上层盖（滑动盖板）的距离是0.45mm。

细胞培养：从沙门氏菌的SpaO区域来的A 296bp片断被扩增，然后用体外基因 T/A克隆试剂盒（Invitrogen，San Diego,CA）克隆至质粒pCR2.1（3890bp）上，按照试剂盒的说明完成连接，连接产物用于将INVαF’转移至合适的大肠杆菌上。转移产物在金属板上扩增，这个金属板含加有氨苄青霉素（100μg/ml）、80μl X-gal(20mg/ml)和4μl异丙基硫代－β-D一半乳糖苷（40mΜ）可以兰/ 白扫描的 Luria－Bertani（LB）介质，用SpaO特殊引物的PCR筛选出真正的克隆，用琼脂糖凝胶电脉检查扩增片段。经PCR筛选的克隆片段在LB介质中于37℃扩增一整夜，并且在225rpm摇动的氨苄青霉素（100μg/ml）液中培养。

细胞混合液的制备：细胞分离缓冲液包括0.05×TBE(4.5μM Tris,4.5μM硼酸，0.1μM EDTA，PH8.2)和250mM蔗糖，PH8.2。缓冲液的传导性用Accumet pH meter 50（Fisher Scientific，匹兹堡，PA）测量是114μS/cm，细胞分离缓冲液的传导性的选择是非常小心的，为了确保大肠杆菌受制于介电电脉的正极，并且所有人血细胞受制于介电电脉的负极，培养的大肠杆菌细胞悬浮液（1ml 含约2×109细胞）被离心机在325G离心4分钟，然后去除浮在表面的一层。在细胞分离缓冲液（1ml）中洗去细胞球，在相同的条件下依上面所述小球化。然后细胞在细胞分离缓冲液（1ml）中重新被悬浮，将新鲜的EDTA一抗凝血剂（20ml含1.46×105白细胞和9.38×107红细胞）加入大肠杆菌的悬浮液中，细胞悬浮液的传导性是315μS/cm。

介电电脉系统：大肠杆菌受限于正极的介电电脉牵引力，血细胞受限于相反的介电电脉牵引力的频率，通过在不同条件下暴露细胞混合物，凭经验被确定。这个研究由逐渐提高开始为5KHz的正弦波频率（相邻峰至峰10v）被传导。当频率达到10KHz，能发现大肠杆菌的分离物和剩余的人血细胞。这个电参数下面会被用来分离大肠杆菌。

介电电脉分离细胞：为了用介电电脉从人血中分离大肠杆菌，一种没用的胶卷被利用，首先通过流动细胞缓冲液冲洗芯片，细胞混合液被泵入流动细胞中，然后泵功能关闭。整个5×5的电极序列通过10v相邻峰至峰，10KHz正弦波固定在checkerboard 的斜线上，泵重新启动开始洗涤过程，当样品混合物从样品/缓冲液池中几乎洗净时，加入分离缓冲液在交流信号仍然存在时从流动细胞中洗去残余样品。洗涤完后，这个含蛋白酶K（490μg; Boehringer Mannheim）的分离缓冲液被泵入流动室。

电子分解产物：为了溶解细胞，在4个计数电极和25个更小的细胞富极电极之间需要提供一系列脉冲（500v，50μs脉宽），这个脉冲是这样提供的，在两组电极间每20个脉冲交替产生极性，每个溶菌过程需总共400个脉冲，这个溶解产物在50℃中培养20分钟，使污染的DNA蛋白消化，溶解产物（300μl）从流动室中被泵出收集，介电电脉分离细胞和电子溶菌的组合被重复6次，所有的溶解产物被集中在一起，收集的溶解产物用16,000G离心5分钟，重新得到浮在表面的一层，并加入2 升冰酒精（-20℃），混合，在16,000G离心10分钟，去掉浮在上面的一层，小球在空气中干燥，然后再溶解至0.05×TBE缓冲液（300μl）中，再溶解得到的碎片溶液（30μl）含Rnase A（3μl，10mg/ml，Boehringer Mannheim），然后在37℃中培养30分钟。

胶质电脉：将600mg溶解的琼脂糖加入50ml 1×TBE的缓冲液中制成A1.2％琼脂糖。在琼脂糖溶液变成固体前还要加入溴乙啶（2.5μg），有或没有RNase的经蛋白酶K处理过的溶解产物样品延标记的DNAs加入啫哩中。

DNA杂交分析：一个寡核苷酸捕获探针，5’－biotin－GAATATCTAACGTTTCCACAATAATTCCCCCTTCA-3’, 对Spa0区域有特异性的质粒DNA通过辅酶在5’末合成。探针被50mM L一组氨酸缓冲稀释得到一个终浓度500nM，捕获探针被固定在覆盖有链亲和霉素琼脂糖的电极上（固定在左面的第一和第三列和1－5和3－5上），但会有正电磁场，这电磁场来自于各个电极上200nA持续1分钟的交流电，之后去掉剩余的探针溶液，芯片用50nM L一组氨酸缓冲液冲洗。生物素控制的寡核苷酸捕获探针ATA5（pad5－5）和不互补的链球菌A(GAS)探针（固定在第二和第四列）的合成，用上面所述来完成，ATA5与RCA5（ref.13）互补，GAS探针来源于化脓性葡萄球菌的speB基因，GAS探针序列如下所示：5’-biotin-GGTAGAGTATCCTAGAATTTCTGGAGAACGTTTATCTCCTGAAAG-3’。一个含互补序列的64－mer的模拟靶（50pM）捕获探针被合成，序列如下：5’-GCGAAAAAGTTAGGTCATTTCAACCGTGTTGGGGGAATTATTGTGGAAACGTTAGATATTCA-3’。为了测试控制，对捕获探针ATA5特异性的经Bodipy Texas Red (BTR)标记在靶样寡核苷酸RCA5（ref.13）（50pM）通过在每个电极上给450nA的交流电3分钟，平行杂交至固定的ATA5探针（pad5-5）和邻近的非特异性GAS探针（pad5-4）上。杂交完后，用新鲜的L-组氨酸缓冲液冲洗，通过150直交流脉冲（1μA 每0.1s开和0.1s关）同时纠正电磁场来完成冲洗，控制杂交试验（i.e.,捕获探针[pad1-5]和非特异性GAS探针[pad1-4] 合成靶的杂交，变性大肠杆菌DNA和带特异性捕获探针[pads 3－1和3－5]和非特异性GAS探针[pads 3-2和3－4]的质粒pCR2.1 [上面提到的不带296bp插入]的混合物用上面所述的相同操作来完成，为了DNA容易杂交，经蛋白酶K处理的溶解产物片断在L－组氨酸缓冲液中被分别稀释3倍和5倍。含稀释溶解产物样品的管子放在100℃水浴中10分钟，打碎DNA（最后DNA序列在300bp至1kb之间），并且得到一个单一的DNA。如上面所述用每个靶样（与5倍稀释的靶样互补的探针在pads1－1，1－3，2－1和2－3与3倍稀释的靶样互补的探针在pads4－1，4－3，5－1和5－3上，非互补探针在与5倍稀释的靶样非互补探针在pads1－2，2－2和与3倍稀释的靶样非互补探针在pads4－2，5－2）来完成杂交。为了传导2层分析，报告探针（5’-BTR-GTTGAAATGACCTAACTTTTTCG-3’）按以下方法杂交，芯片在室温下放入1×STE（150mM硫化钠，10mM Tris－HCI,1 mM EDTA,PH8.0）含超声处理的变性的小牛胸腺DNA（100μg/ml，Sigma）的缓冲液中放置5分钟，然后去除缓冲液，将10μl混合液（500nM在含小牛胸腺DNA的1×STE缓冲液中的报告探针）置于芯片上，在室温中放置5分钟，芯片用由0.2×STE制成的1％SDS的缓冲液10μl冲洗5次，然后常温下在5ml相同的缓冲液中浸10分钟，最后用0.2×STE冲洗5次。

RNA杂交：寡核苷酸捕获探针5’-biotin-GAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACGCAC TTTA-3’对16SRNA有特异性，在3，末与之结合，探针在50mM L－组氨酸缓冲液中稀释，得到终浓度为500nM，捕捉探针固定在带电磁场的链亲和素的实验微位置上，正电磁场通过在每个电极上200nA特续1分钟的交流电产生，去除剩余探针溶液，芯片用50mM L－组氨酸缓冲液冲洗，GAS探针（非特异性控制）的固定是通过如上所述的操作来完成的，为了测试捕获探针的特异性，合成的靶样寡核苷酸（5’-AATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTATGCAACTCG-3’，50pM）通过持续给每个电极450nA3分钟的交流电平行电杂交至固定的互补探针和邻近的非互补探针上。为了使16SRNA容易杂交，经蛋白酶K处理过的溶解产物碎片分别用L－组氨酸缓冲液稀释3次和5次。同时稀释溶解产物样品与质粒DNA杂交，杂交完成后，新鲜的三磷酸缓冲液(20mM Tris-base,20mM di-basic 磷酸钠PH9.0)取代旧的L－组氨酸缓冲液来完成严格的电子冲洗。冲洗靠同时将70直交流脉冲至一排负的电磁场，750nA每pad0.1s开0.1s关来完成。为了传导2层分析报告探针的杂交如下：报告探针的混合序列为：5’-BTR-TCC GACTTCATGGAGTC-3’，5’-BTR-TGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGA-3’和 5’-GGTCGCTTC TCTTTGTATGCGCCATT-BTR-3’。芯片在室温下放入1×STE（10μl）含超声处理的变性小牛胸腺DNA的缓冲液中放置5分钟，然后去除缓冲液，将15μl的混合溶液（500nM在含前述小牛胸腺DNA的1×STE缓冲液中的报告探针）加在芯片上，在室温中放置5分钟。然后芯片用0.2×STE 制成的1％SDS的缓冲液15μl冲洗5次，在常温下浸入5ml相同的缓冲液10分钟，最后芯片用0.2×STE冲洗5次。

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白云区15723695549： 高级筛选时,条件区域如何设置:筛选包含1的项目,若包含12则不符合,若1和12都包括,则符合. - ？
度琪怡安： 步骤:1、建立辅助列,C1标题为“筛选”(名称任意),在C2中输入公式:=ISNUMBER(FIND(＂1＂,SUBSTITUTE(B2,＂12＂,＂＂))),下拉;2、建立条件区域,假设在D1:D2,D1中输入“筛选”,D2中输入“TRUE”;3、进行高级筛选:数据区域:A1:C6;条件区域:D1:D2.

白云区15723695549： excel:如何用筛选功能 ,选出包含所列出的多个关键字之中任意一个的项. - ？
度琪怡安： a列字段名aaabbbccc条件放在同一列,高级筛选,条件一起选中.

白云区15723695549： Excel怎么筛选出特定格式的项目?比如筛选出所有”*【*】*“带此特征的单元格? - ？
度琪怡安： 有,筛选条件选包含,包含内容输入[*]就可以了.

白云区15723695549： 如何在Execl中对表格的某一列进行筛选,将包含特定文字的行显示出来??？
度琪怡安： 在筛选下拉箭头中选择自定义自动筛选---包含---输入特定文字即可 补充: 可以添加一辅助列,输入:=if(LEN(A1)-LEN(SUBSTITUTE(SUBSTITUTE(SUBSTITUTE(A1,＂张三＂,＂＂),＂李四＂,＂＂),＂王五＂,＂＂)) &gt;0,“包含＂,＂＂) 向下填充. 然后对该列进行自定义筛选“包含”即可.

白云区15723695549： excel 如何才能够一列中选出含有某个值的所有表格? - ？
度琪怡安： 选中C132,至C268,点“数据”选项卡下的筛选,会看到C132旁边有个下拉箭头,点那个箭头,在下拉层里选文本筛选->自定义筛选,然后在出来的设置层里第一行第一个下拉框中选“包含”,第二个输入框里填“磨机”,确定,就行了

白云区15723695549： 想在EXCEL表格C列里面把带有指定数据称筛选出来,求助 - ？
度琪怡安： 你用的office零几? 先全选 数据——筛选 然后你会在C列C1上看到一个向下的图标,点它,选择你爱的LED

白云区15723695549： 如何在EXCEL2003中的自定义筛选中将含特定的文字筛选出来? - ？
度琪怡安： 如果是excel2007版的,直接在筛选中操作.如果是excel2003版的,要如下操作:“编辑-查找”,在出现的对话框中点右边“格式”,选图案,在里面点选一个要查找的单元格的颜色(蓝色),确定,回到“编辑与查找”对话框,点“查找全部”,这时下面就出现一个框,所有蓝色的单元格都被显示出来,这是要按CTRL+A键,选中所有单元格就可以后续操作了.

白云区15723695549： 还是用RP这外软件,怎么筛选出excel表格中包括指定关键词的行? - ？
度琪怡安： 首先excel文件需要保存为csv格式.1. 打开replace pioneer, ctrl-o打开csv文件2. ctrl-h打开replace窗口* replace unit选Line* 在if输入words($match,1...

白云区15723695549： Excel如何筛选包含特定值的行,并将这些行筛选或者复制出来 - ？
度琪怡安： 两种做法一、数组公式筛选,数据量大的话可能有点卡 A14=IFERROR(INDEX(A:A,SMALL(IF(ISERROR(FIND(＂M＂,$A$2:$A$11&$B$2:$B$11&$C$2:$C$11&$D$2:$D$11&$E$2:$E$11&$F$2:$F$11&$G$2:$G$11&$H$2:$H$11&$I$2:$I$...

白云区15723695549： excel如何用vba或函数实现筛选出选定的一列里包含特定字符串的单元格所在的行,并隐藏其它不符条？
度琪怡安： =IF(COUNTIF(A1:C1,＂*a*＂),INDEX(A1:C1,MATCH(＂*a*＂,A1:C1,)),＂＂)