免疫细胞化学技术的概述

免疫细胞化学技术的介绍~

免疫细胞化学，又称免疫组织化学，其主要原理是用标记的抗体或抗原对细胞相应抗原或抗体进行定性、定位或定量检测，经过化学的呈色反应后，用显微镜或电子显微镜观察。该技术是免疫荧光技术与形态学技术结合的产物。

免疫组化是什么？ 是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。 · 具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。
– 对抗体的要求：纯度高、比活性强；
· 高度特异性抗体的获得，取决于抗原的纯度。
– 对抗原的要求：纯度高，免疫原性强，稳定无变化。 · 抗原的概念：凡是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反应的物质，称为抗原。抗原具有两个方面的特性：
– 免疫原性：引起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特性；
– 免疫反应性：抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。
· 根据抗原是否显示免疫原性分为：
– 完全抗原：分子量较大，一般在10kDa以上，并具有较复杂的化学组成。
· 免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。
– 半抗原：又称为不完全抗原，分子量较小。例如：某些短肽、多糖、类脂和药物等。
· 半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。
载 体
· 通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。
– 常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)等。
– 用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。结合比例为5kDa结合5～25个分子的小肽。 1、抗体的概念：
· 机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白，被称为抗体。
– 抗体主要存在于血清内；
– 抗体都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗体。
– 免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，既IgG、 IgD、IgE、 IgA、IgM。
2、免疫组化实验中常用的抗体：单克隆抗体和多克隆抗体。
· 单克隆抗体：是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。
– 特异性强、抗体产量高。
· 多克隆抗体：是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
– 特异性低，会产生抗体的交叉反应。
– 多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片，可减少假阴性染色机会。
– 抗原与抗体的结合，要求量保持一定比例，当抗原或抗体过量时，是不能聚合成大颗粒。
3、抗体的制备——多克隆抗体的制备
· 动物的选择
· 佐剂(adjuvant)
· 免疫方法
· 免疫剂量
· 抗体效价的测定
· 放血或定期抽血
(1) 动物的选择
选择什么动物来免疫取决于：
· 所需抗血清的量
– 小鼠只能提供1.0～1.5ml的血液，而山羊能提供几升。
· 能供免疫用的抗原量
– 小鼠50μg足够，而山羊需要几毫克。
(1) 动物的选择(续)
· 动物的品系：免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。
– 例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。
– 常用的动物有兔、羊、马、猪等，以兔(新西兰兔，年轻，健壮，体重在2.5kg左右，雄性)为最常用。
(2) 佐剂 (adjuvant)
· 一般可溶性抗原注射后，迅速从注射部位扩散、吸收代谢。佐剂可延长滞留时间，且延长免疫刺激作用。因此在制备抗体的过程中，常将抗原和佐剂一起注射。
· 最常用的佐剂是弗氏佐剂，又分为：
– 弗氏不完全佐剂(Freund's incomplete adjuvant)
– 弗氏完全佐剂(Freund's complete adjuvant)
弗氏不完全佐剂
(Freund's incomplete adjuvant, FIA)
· 是由油剂(石蜡油或植物油)与乳化剂(羊毛脂或Tween80)混合而成，比例为1:1、2:1、3:1或5:1，可根据需要而定，通常2:1。
· 使用时与水溶性抗原按1:1比例充分混合，使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂。
弗氏完全佐剂 (Freund's complete adjuvant, FCA)
· 在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌(终浓度为2～20mg/ml)，即成为FCA。
· 免疫动物时，将弗氏佐剂与抗原按体积 1:1 混合乳化后(油包水)注入动物。
– 一般首次注射时用完全佐剂乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。
佐剂与抗原乳化的方法
· 研磨法：适于制备大量的佐剂抗原
– 先将不完全佐剂加热，取1.73ml放人无菌玻璃研钵内；缓缓滴入0.23ml活卡介苗，边滴边按同一方向研磨，使菌体完全分散。
– 按同样方法滴人抗原，每加一滴应研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。
· 缺点：研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大，对微量或难得抗原不宜采用。
佐剂与抗原乳化的方法(续)
· 注射器混合法
– 将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内，然后插入三通管内，交替推动针管混匀，往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。
· 优点：无菌操作，节省抗原或佐剂。
· 缺点：不易乳化，时间长。
佐剂与抗原乳化的方法(续)
· 快速乳化法：利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。
– 将抗原和佐剂按所需量加入一离心管中，置于超声波粉碎器上，粉碎头浸入液面下 0.5cm，离瓶底0.5cm左右，以免打碎离心管。
– 每次乳化 10～15s，然后置冰箱lmin左右。反复乳化3～4次即可完全乳化。管内残余量800r/min离心5～10min收集。
· 优点：简单、快速、节省材料。
乳化剂的鉴定
· 判断乳化是否充分，可将一滴乳化好的液体滴在水面上(冷水中)，如能长时间保持圆珠形而不散开，表示乳化达到要求。
(3) 免疫方法——免疫途径
· 常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等注射。
· 一般采用多点注射方法
– 常在足、掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。
– 皮内易引起细胞免疫反应，有利于提高抗体的效价。
(3) 免疫方法——免疫途径 (续)
· 几点说明：
– 大动物一般不用腹腔注射
– 颗粒抗原和使用佐剂时不能静脉注射
– 抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法，只需10～100g抗原即可获得较好的免疫效果。
– 皮内注射较困难，特别是天冷时更难注入。
(3) 免疫方法——次数及间隔时间
· 次数一般为2～3次(初次免疫和加强免疫)
– 首次注射后，10～15天再加强注射；
– 剂量同首次或为首次的一半，用不全佐剂或不用佐剂。
· 间隔时间，一般而言，动物越大，间隔越长
– 豚鼠、大鼠为7～8天，兔子为10～15天，羊为14～28天；
– 第三次注射的间隔时间更长些，效果更好。
举例1：家兔的免疫
· 初次免疫
– 用50～200g Ag加入FCA，在背部皮下注射6～8点，每点0.1～0.2ml，也可肌肉内或皮内注射；
· 两周后，加强免疫
– 将50～200g Ag于PBS或FIA中，在肌肉、皮下、静脉或腹腔内注射；
· 抗体效价的检测：加强免疫一周后，耳缘静脉采血
– 抗体效价测定可用环状沉淀试验、琼脂双向扩散法等方法。前者抗体效价在1:4000以上，后者在1:16以上，即可采血，取血清进一步提纯。
举例2：微量抗原淋巴结内注射免疫家兔
· 一般选择2.5～3.0kg的新西兰种公兔
– 先在其两脚垫注射完全福氏佐剂0.2ml(卡介苗每兔合5mg)；
– 10天后，见胭窝淋巴结肿大，然后将抗原注射至肿大的淋巴结内，第一次注射抗原用完全福氏佐剂混合乳化；
– 以后每隔20天用不完全福氏佐剂乳化抗原，以同样方法加强2次，各次注射的抗原均为25～50g；
– 末次注射两周后兔耳放血测价 (可达1:128)。
举例3：豚鼠和大鼠的免疫
· 初次免疫
– 用10～100g Ag加入FCA，在背部皮内注射4～6点，每点 0.lml，也可肌肉内或皮下注射；
· 加强免疫
– 每隔 7～8天，将10～50g Ag于 PBS或FIA中。在肌肉、皮下或静脉注射；
· 抗体效价的检测
(4) 免疫剂量
· 抗原性强的抗原量应小，过大反会引起免疫抑制；
· 免疫周期长的动物可少量多次注射，短的可大量少次。
(4) 免疫剂量 (续)
· 各种动物首次免疫抗原剂量和加强免疫的剂量
(5) 抗体效价的检测
多采免疫双向扩散法
【基本原理】
· 指抗原和抗体在同一凝胶内都扩散，彼此相遇后形成特异性的沉淀线。
– 将抗原与抗体分别加入同一凝胶板中两个相隔一定间距的小孔内，使两者进行相互扩散，当抗原抗体浓度之比相适宜时，彼此相遇形成一白色弧状沉淀线。
· 优缺点：简便，但敏感性较低，易出现假阴性结果。
免疫双向扩散法的操作步骤
· 将玻璃板用水洗净后用75%乙醇冲洗，晾干后放在水平台上备用。
· 将l % agar 融化后，置56C水浴。
· 在玻璃板上铺胶，约1.5mm 厚，凝固后打孔(直径 3rnm)，孔间距10mm。
· 中心孔加5l 抗原样品，周围孔内每孔加5l 抗血清(抗体预先作系列倍比稀释即 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32等比例)。
· 凝胶板置湿盒内，室温扩散24h。
· 观察结果。
抗体效价检测的其它方法
· 环状沉淀试验，需较多的抗血清，现已很少用；
· 对流免疫电泳，比琼脂免疫双扩散法敏感，较简便、实用；
· 酶联免疫吸附试验 (ELISA)。
(6) 放血或定期抽血
常用以下3种方法
· 颈动脉放血法：放血量较多，动物不易中途死亡。例如：2.5kg白兔可放血约80ml。家兔、山羊、绵羊等动物采血常用此法。
· 心脏采血法：常用于家兔、豚鼠、大白鼠、鸡等小动物，但操作不当易引起动物死亡。
· 静脉采血：家兔可用耳缘静脉采血；山羊、绵羊、马和驴可用颈静脉采血，这种放血法可隔日1次，有时可采集多量血液。
(6) 放血或定期抽血 (续)
· 采血过程中，动作要轻柔，尽量避免溶血
· 血液凝固后，及时离心收集血清，否则细胞溶解释放的杂蛋白(例如蛋白水解酶)将污染抗体并将抗体水解，降低效价；
· 加叠氮化钠，分装，低温保存，也可加一定的保护剂如BSA、甘油等。

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平乡县17082117163： 免疫细胞化学技术 - 搜狗百科？
方莺左旋： 免疫细胞化学,又称免疫组织化学,其主要原理是用标记的抗体或抗原对细胞相应抗原或抗体进行定性、定位或定量检测,经过化学的呈色反应后,用显微镜或电子显微镜观察.该技术是免疫荧光技术与形态学技术结合的产物.

平乡县17082117163： 什么是免疫组织化学 - ？
方莺左旋： 免疫组化是什么? 是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry).

平乡县17082117163： 医学常识中免疫组织化学技术的概念及基本操作步骤有哪些? ？
方莺左旋： 免疫组织化学技术是指在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应,借助可见的标记物,对相应抗原或抗体进行定位、定性和定量检测的一种免疫检测方法.它是免疫反应的特异性和组织化学的可见性巧妙地结合,借助显微镜的显像和放大作用,在细胞、亚细胞水平检测各种抗原或抗体物质.免疫组织化学的基本操作包括以下步骤:抗原的提取与纯化.免疫动物或细胞融合,制备特异性抗体及纯化.标记物与抗体结合形成标记抗体.标本的处理.抗原抗体反应和呈色反应.显微镜下观察结果.

平乡县17082117163： 免疫荧光细胞化学的原理是什么? - ？
方莺左旋： 免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理,先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物,再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体). 在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素,利用荧光显微镜观察标本,荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色),可以看见荧光所在的细胞或组织,从而确定抗原或抗体的性质、定位,以及利用定量技术测定含量. 详细的方法可以到生物帮了解一下,< http://www.bio1000.com/zt/dna/4460.html > 端粒,端粒DNA,端粒和端粒酶,端粒酶的作用,端粒的作用,端粒的功能,端粒的组成结构,端粒酶是什么,基因端粒的长度,端粒的定义.

平乡县17082117163： 免疫细胞化学技术常用的标记物有哪些? - ？
方莺左旋： 博凌科为解答:免疫细胞化学技术是用已知的抗体检测组织与细胞中相应抗原的方法,但抗原抗体相结合的复合物在显微镜下是看不见 的,必须用特殊的标记物对抗体或抗原抗体复合物进行标记,才能使抗原抗体复合物在显微镜下具有可见性....

平乡县17082117163： 简述免疫活性细胞的生物学功能 - ？
方莺左旋： 免疫活性细胞组成人体免疫系统组织、器官,是维持人体内外环境稳定,消除体内外抗原性物质之危害,起着免疫监视作用,是当代重视和研究地十分深入的领域.免疫活性细胞主要包括淋巴细胞、单核/巨噬细胞及网状细胞等.它们产生的肿瘤—...

平乡县17082117163： 原位杂交技术和免疫细胞化学技术的联系与区别 - ？
方莺左旋： 原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列,将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对,结合成专一的核酸杂交分子,经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来.免疫细胞化学是用标记的特异性抗体(或抗原)对组织内抗原(或抗体)的分布进行组织和细胞原位检测技术.一个是用核酸序列检测,一个使用抗体或抗原检测它们都可以定位

平乡县17082117163： 免疫细胞化学的步骤和免疫组化的步骤一样吗?请问这两种方法的步骤有什么不同? - ？
方莺左旋：[答案] 免疫细胞化学分为细胞块免疫细胞化学和细胞涂片免疫细胞化学. 前者和免疫组化基本上一致,多了和细胞制块的步骤. 后者和免疫组化不太一致,一抗之前不一样,后面都一样.