免疫学技术知识总结 第二章

~ 第二章 抗体制备技术

抗体的基本概念：多克隆抗体（多个淋巴细胞克隆所分泌的抗体）和单克隆抗体（单个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体）

单克隆抗体的特点：

高度均质（同一亚类），化学组成均一，不含或很少含Ig

特异性强，只针对某一种抗原表位

亲和力强

抗原用量少，无须纯化

无批间差异

来源稳定，可达批生产，容易标准化

不易形成沉淀线

操作比较麻烦

什么条件下需要制备单抗：

目的蛋白有类似的结构

抗原不纯，无法分开

多抗的效果不好（已经排除非特异性反应）

希望将抗体用于治疗，研制成药物

希望将抗体用于诊断，研制成诊断试剂。

第一节   多克隆抗体的之别

一、多克隆抗体制备的原理

抗体制备、动物免疫、抗体纯化

二、多抗的基本条件

1.   免疫原的制备

颗粒性抗原：细胞、病毒、细菌等，一般具有较强的免疫原性，可以不加佐剂，直接进行腹腔注射。

可溶性抗原：可溶性抗原的来源主要是天然纯化，或者用目的基因在原核细胞或者真核细胞中表达，可溶性抗原需要与弗氏佐剂完全或不完全混匀，才可以进行免疫。

（1） 完全抗原的提取：细胞破碎法、抗原提取、抗原的纯化

（2）半抗原与载体的交联：载体的选择、半抗原与载体偶联的方法、偶联复合物的鉴定

（3）合成肽抗原：免疫原性肽的选择、肽的合成和纯化

2. 免疫动物的选择：

3.   佐剂的准备：

佐剂的种类：无机佐剂、有机佐剂、合成佐剂、油剂

三、多克隆抗体制备的基本方法

1.  抗原计量、免疫途径与免疫日程

免疫动物的方法：

免疫原值被：

无佐剂免疫法：适用于颗粒性抗原

弗氏佐剂免疫法：适用于可溶性抗原

铝佐剂免疫法：适用于人的免疫

免疫动物（一般选择雌性动物，温顺并且可以生产）

皮内免疫法

皮下或肌肉免疫法

淋巴结免疫法

混合法

抗体效价满意后静脉注射加强免疫

常见的注射方法；皮下注射、皮内注射、尾静脉注射、静脉注射

2.   小样试血与采血

抗血清的获得：眼眶取血、颈动脉放血、心脏采血

免疫效果评价：取血（兔耳动脉、鼠尾静脉）、检测（双向免疫扩散、ELISA）

3.   抗体的分离和纯化技术

盐析法、凝胶过滤法、离子交换层析、亲和层析法、电泳分离法

亲和层析法原理：利用蛋白质之间的特异性结合（抗原-抗体、受体-配体）将一种配基与凝胶颗粒结合，捕捉与他相配的物质，洗脱另外一种物质，并且洗脱一般用改变pH的方法。

主要步骤：将蛋白质与活化柱子结合，将腹水或者血清处理后过柱子，用结合缓冲液洗柱子（知道A280为零），永安氨酸缓冲液洗脱抗体，等量收集洗脱液，测定洗脱液的A280值，保留A280值明显升高的样品。

4.   抗体的鉴定

蛋白质浓度的测定：紫外分光比色法、双缩脲法、福林酚法、

免疫效果评价：双向免疫扩散、ELISA

纯度分析：免疫印迹（WB）

抗体类别分析：免疫金试条

亲和力分析：ELISA、荧光偏振

5.  抗体的保存

抗体的浓缩：吸收、蒸发、超滤

抗体的保存：浓缩抗议+甘油+防腐剂

免疫效果不佳的原因可能是：抗原纯度不够、免疫原性低、免疫途径乳化不合格、免疫剂量不合适、动物疾病或者种属差异小。

第二节  单克隆抗体制备技术

一、单克隆抗体制备的原理

1个B细胞只能产生1个抗体。方法是细胞工程杂交技术和B细胞杂交瘤技术

需要将单克隆B细胞和肿瘤细胞相结合才可以永久产生单抗

Barski等发现细胞额自然融合现象，但是频率很低

冈田等发现灭火的仙台禀赋和聚乙二醇能显著提高细胞融合的效率。

二、单抗制备的基本条件

需要培养正常的B细胞以及B细胞融合的肿瘤细胞

1.   动物的免疫抗原与载体、动物的选择、免疫途径

举例：小鼠免疫

第一次免疫：可溶性抗原加弗氏完全佐剂——小鼠背部皮下注射（4周后）

第二次免疫：可溶性抗原加弗氏不完全佐剂——小鼠背部皮下注射（3周后）

第三次免疫：可溶性抗原加生理盐水——小鼠腹腔注射（10天后检测血清效价）

加强免疫：可溶性抗原加生理盐水——小鼠腹腔注射（3天后）

细胞融合

2.  酶缺陷型骨髓瘤细胞的培养

细胞DNA合成途径：

次黄嘌呤（H）通过嘌呤合成跑路途经合成HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）进一步合成鸟嘌呤核苷酸

胸腺嘧啶核苷（T）通过嘧啶合成旁路途经合成TK（胸腺嘧啶核苷激酶），进一步合成胸腺嘧啶脱氧核苷酸

氨基酸、谷氨酰胺、鸟核苷单磷酸通过核酸生物合成主要途径结合上面两步合成的鸟嘌呤核苷酸以及胸腺嘧啶脱氧核苷酸形成DNA

将第三步当中氨基端变为氨基碟呤（A），则无法形成DNA。

因此酶缺陷型细胞的筛选就是HAT筛选

3.   单抗检测方法的建立

免疫酶技术

免疫荧光技术

免疫扩散技术

三、单抗制备的基本方法

1.   酶缺陷型骨髓瘤细胞的培养

组织培养的基本条件：

仪器：包括CO2培养箱、倒置显微镜、超净台、液氮罐、低速低温离心机

试剂：培养液、HAT选择培养液、HT培养液、血清、抗生素

耗材：培养板、培养品、吸管、移液管

骨髓瘤细胞系的选择要点：

（1）  所选的骨髓瘤细胞应与提供免疫脾细胞的动物品系相同

（2）  自身不产生免疫球蛋白的重链和轻链

（3）  对氨基碟呤敏感

（4）  与免疫脾细胞融合后产生稳定分泌的Ig杂交细胞

2.   饲养细胞的制备

饲养细胞的作用：

（1） 增加细胞浓度，满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的要求

（2）  吞噬清楚死亡的细胞

（3）  分泌生长刺激因子促进杂交瘤细胞的生长

饲养细胞的种类和制备方法

（1）  小鼠腹腔巨噬细胞

（2）  小鼠脾细胞

（3）  成纤维细胞

3.     脾细胞的分离

（1）  拉颈椎处死小鼠

（2）  无菌操作取出脾脏

（3）  清洗、研磨

（4）  收集细胞

（5）  离心洗涤

（6）  细胞计数

4.     细胞融合：骨髓瘤细胞和脾细胞按照1:10或1:5的比例混合并加入促融剂PEG

细胞融合的方法：PEG融合、仙台病毒、电融合

5.    HAT选择性培养

       HAT选择性培养的原理：细胞的DNA生物合成右主要途径和补偿途径。当A存在是，能够阻断DNA合成的主要途径，须通过补偿途径合成DNA，这时就需要HGPRT利用H合成DNA，或者TK利用T合成DNA。

       由于选用西黄嘌呤鸟嘌呤荷塘转移酶缺陷型（HPRR-）骨髓瘤在细胞或者胸腺嘧啶割肝激酶缺陷型（TK-）细胞作为亲本，该校只能通过群全条件的DNA培养基才可合成，因此杂种细胞通过互补作用获得HGPPT或者TK基因。只有杂种细胞可以活，酶缺乏性细胞完全无法存活，单克隆B细胞一般不能长期生长，就起到了分离杂交细胞的作用。

       细胞生长情况：融合3-4天之后，可以看到刑诉骨髓瘤细胞，混元透亮的克隆。融合后第7-9天去培养上清，检测特异性抗体。

       筛选后存活的细胞就是脾细胞和骨髓瘤细胞融合细胞。

6.     阳性克隆的筛选

分泌单克隆抗体杂交瘤细胞的检测方法

免疫酶技术：简介ELISA法

免疫荧光技术：间接免疫荧光测定法、流式细胞分析技术（阴性对照：骨髓瘤细胞培养上清，阳性对照：免疫鼠血清）

7.     克隆化培养：阳性细胞的单克隆化

克隆是指由单个细胞繁殖、扩增而形成的性状均一的细胞集落的过程。

常见方法有：有限稀释法和软琼脂克隆技术

有限稀释法：从阳性分泌孔收集杂交瘤细胞。

软琼脂克隆技术：从阳性分泌孔中收集杂交瘤细胞，一适当浓度杂交瘤细胞加入到软琼脂培养基中，形成有一个细胞增殖来的细胞集群。

单克隆抗体的鉴定：

（1）  抗体敏感性检测：对腹水和培养基上清进行效价测定

（2）  抗体特异性鉴定：是否与其他抗原右交互反应。

（3） 抗体效价测定

（4）  抗体亚类鉴定：IgG（IgG1、IgG2、IgG3）、IgM

（5）  抗体亲和力鉴定

（6）  识别表位分析

8.    单克隆抗体的扩大生产：细胞培养法、小鼠体内诱生法、生物反应器

细胞培养法：杂交瘤细胞、培养瓶或罐中培养、收集上清液、纯化抗体

动物体内诱生法：Balb/c小鼠、腹腔注射0.5ml液体是啦或降植烷、腹腔内接种杂交瘤细胞、收集腹水

生物反应器：发酵罐培养

单抗培养常见的问题：

（1）  污染：培养环境、操作

（2）  融合细胞不生长：PEG、血清、HAT培养基

（3）  抗体分泌不足：支原体污染、细胞突变、培养体系有问题

（4）  杂交瘤细胞难以克隆化：血清质量、细胞活性

第三节  基因工程抗体制备技术

基因工程抗体：通过基因工程的手段，按照个人意愿进行细胞人工改造的技术。

优点主要有：特异性高、质量稳定、成本低廉、工艺简单、异源性滴低、穿透性好、功能丰富。

一、鼠源抗体人源化

鼠源抗体应用中的障碍：免疫原性、半衰期短、抗体功能片段失活。

1.     嵌合抗体：可变区基因克隆、表达载体的构建、嵌合抗体的表达

2.     改型抗体

二、小分子抗体：Fab抗体、Fv抗体和单链抗体、单域抗体、最小识别单位

小分子抗体的优点：

（1）可在原核体系中表达，降低生产成本。

（2）因为其分子量小，穿透能力强，易进入病灶部位，有利于对肿瘤等疾病的治疗。

（3）不含Fc片段，不与Fc受体结合，可减少因广泛分布的Fc受体而带来的不利影响。

（4）在体内半衰期短，有利于体内毒性物质的消除

（5）易于进一步基因工程分改造。

三、]基于抗体的应用

1.     CAR-T免疫治疗：

       CAR-T免疫疗法：即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，是一种新型的过继性细胞疗法，即利用病人自身的免疫细胞来清除癌细胞的细胞疗法，并非药物。

       CAR-T技术：通过整个嵌合抗原受体的经过基因修饰的T细胞抵抗肿瘤细胞的疗法。嵌合抗原受体可以特异性识别肿瘤相关抗原或者肿瘤特异性抗原，识别结合后将激活及增值信号传递到T细胞内，引起T细胞激活，增殖释放细胞因子，从而杀伤肿瘤细胞。

2. 免疫检查点

3.  免疫毒素

4.  ADC

5.  双特异性抗体

第四节  [endif]抗体库技术

抗体库技术：即用基因克隆技术将全套抗体轻重链可变区基因克隆出来，重组到原核表达载体上，通过原核系统直接表达有功能的抗体分子片段，并筛选出特异性的抗体分子和可变区基因。

一、噬菌体展示技术原理：噬菌体展示技术是将外源蛋白质或者DNA序列查到噬菌体外壳上的适当位置，使外源基因随着外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随着噬菌体的重新组装而展现倒是菌体表面的生物技术。到目前为止，人们已经靠发出单链丝状噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统等。

二、噬菌体抗体制备的基本程序

1.     收集淋巴细胞提取mRNA并转录到cDNA或直接提取斯堡基因组的DNA

2.     扩增DNA的抗体可变区基因

3.     [构建重组噬菌体库

4.     筛选所需特征的重组噬菌体

5.     采用突变或链置换使亲和力成熟

三、噬菌体抗体技术的特点

1.     筛选步骤简单、快速、有效

2.     扩大了筛选流量，一次就可以筛选多于1010个的克隆

3.     抗体基因型与表现性联系密切，基因稳定且容易改造

4.    模拟天然免疫系统亲和力成熟过程

5.     无需人工接种

6.     可替代动物多克隆抗体

7.     构建康体苦时。轻重链可变区基因在体外随机组合，可产生体内部存在的轻重链组合，得到新的特异性抗体。

8.     可以在预案和系统中表达，大规模生产方便，且成本低。

四、抗体库技术的应用

1.     制备全人源抗体

2.     改良基因工程抗体

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