石蜡切片的与免疫学技术结合

石蜡切片的石蜡切片制作基本技术~

染色后的切片尚不能在显微镜下观察，需经梯度酒精脱水，在95%及纯酒精中的时间可适当加长以保证脱水彻底；如染液为酒精配制，则应缩短在酒精中的时间，以免脱色。二甲苯透明后，迅速擦去材料周围多余液体，滴加适量（1～2滴）中性树胶，再将洁净盖玻片倾斜放下，以免出现气泡，封片后即制成永久性玻片标本，在光镜下可长期反复观察。注意有些染料需特定厂家生产的产品。根据各种染色方法、组织类别及切片厚度，掌握适宜的染色时间，才能达到较好的染色效果。石蜡制片程序及环节繁多，需数日才能完成1个周期，但切片可长期保存，供教学、科研及病理诊断及复察，并可利用蜡块作其他项目的回顾性研究。病理常规制片过程中已简化了一些细的环节或缩短了部分处理时间以适应临床需要（可缩短至2天）。虽然冰冻切片大大快于石蜡切片，但所显示的形态结构却不如前者，因此病理医生最后还需要根据石蜡切片作出准确诊断。近些年来，在病理常规制片过程中采用了微波技术，从而大大缩短了制片过程，而且对形态结构并没有影响。微波是一种波长很短、频率却很高的高频电磁波[波长为1米 ～1毫米，频率为300兆赫（MHz）～300千兆赫（GHz）]。组织经微波辐射后加速组织内部分子的高速运动，以使液体的运输加快，增加弥散、渗透和交换效率，从而加速组织的固定、脱水、透明、包埋和染色各个环节。例如常规福尔马林固定需数小时～1天，而且能引起组织收缩及某些抗原成分不同程度的受到破坏，微波固定仅需1～2分钟，且可减少抗原的丢失和损害。选择适当的档次（功率）、辐射时间和温度是极为重要的。目前微波技术的应用在国内尚处于起步阶段，许多技术应用环节尚需进一步摸索。 石蜡切片不仅是经典的方法，又是最基本的方法，它与其他新的技术方法相结合，使传统的老技术扩大了应用范围，开辟了许多新领域，增加了许多新的研究、观察内容。随新的仪器及新的研究技术的不断问世及使用，使组织学的观察研究从简单的形态结构深入到各种成分的定性观察，又从定性转向定量计测，使细胞组织的形态，功能及代谢三结合，从而达到定性可靠、定位准确及定量可测。

石蜡切片（paraffin section） 组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。教学中，光镜下观察切片标本多数是石蜡切片法制备的。活的细胞或组织多为无色透明，各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别出；组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败，失去原有正常结构，因此，组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡，而能清晰辨认其形态结构。

超薄切片技术由于电镜产生的电子束穿透能力很弱，必须把标本切成厚度小于0.1um以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。在透射电镜的样品制备方法中，超薄切片技术是最基本、最常用的制备技术。超薄切片的制作过程基本上和石蜡切片相似，需要经过取材、固定、脱水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步骤。

组织制片技术与免疫学技术结合构成免疫组织（细胞）化学技术，利用抗原与抗体的特异性结合原理，检测组织切片中细胞组织的多肽及蛋白质等大分子物质的定性和定位观察研究。不论哪种免疫组织化学技术都包括抗体的制备、组织材料处理、制备玻片标本以及免疫染色。冰冻切片手续简便，制片过程中抗原活性丢失少，但组织细胞形态较差；石蜡切片步骤繁多，制片中抗原活性有所减低，但组织细胞形态清晰，是免疫组织化学常规制备切片方法之一。一般石蜡包埋的组织切片用于检测胞浆或核内的抗原，不宜做表面抗原染色，有人将新鲜组织浸泡于冷磷酸缓冲液内48小时，再固定于96%乙醇或其他固定液固定的组织切片，可用于表面抗原染色。乙醇、丙酮等固定剂对抗原破坏较轻，但结构保存较差。最常用的固定液有中性和缓冲福尔马林，它可与蛋白质交叉结合封闭抗原，在进行免疫染色前，切片再用蛋白酶消化，以暴露抗原部位、增强抗原的反应。在石蜡切片上进行的常用的免疫组化染色有免疫酶组织化学技术中的PAP法（非标记过氧化物酶-抗过氧化物酶法）及亲和免疫组织化学技术中的ABC法（抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物技术），其特异性强、敏感性高。使用两种染色法的组织切片都需先经第一抗体（各种抗血清）孵育；再经第二抗体或生物素标记的第二抗体孵育；后经PAP复和物或ABC复合物孵育，最后以DAB（二氨基联苯胺）-H2O2液显色呈棕黄色沉淀。常规复染、脱水、透明、封片成永久性玻片标本，光镜下检测常规或特殊染色法难以显示的成分及其精确定位，可用于基础研究及临床病理研究及诊断。微波用于石蜡包埋切片免疫组织化学染色既简化步骤又节省时间，且能促进免疫染色效果。
石蜡包埋组织流式细胞仪DNA含量分析 是石蜡包埋组织切片与流式细胞术（flow cytometry，FCM）结合使用来测量DNA含量及倍体分析，这一结合是流式细胞仪在临床应用中，特别是在肿瘤研究方面开拓了新的研究途径。FCM是激光、电子和电子计算机、流体喷射技术的综合发展应用，是快速定量分析细胞的技术，要求被检细胞呈悬浮状态。目前已可测量细胞的大小、体积、DNA含量、DNA合成速率、RNA含量、表面抗原、染色体等。由于制备样品技术的原因，过去许多流式分析资料仅限于采用新鲜组织标本，Hedley等1983年首先报导了FCM分析石蜡包埋组织切片制备分散细胞悬液技术来进行DNA含量的检测，从组织切片中能获得足够数量的单个细胞，且与新鲜组织分离获得的单个细胞在形态及DNA含量组方图上均极为相似。目前国内也在逐步开展这方面的研究。由于这种方法取材可在病理组织观察或诊断基础上进行，比活检或手术切除标本更为准确，又可做回顾性研究分析；且对DNA检测速度快、数据客观可靠，在肿瘤诊断、预后的预测和治疗反应上具有重要价值；利用过去的标本可成批制作细胞悬液、成批上机测试，避免了仪器调试状态不同带来的影响，石蜡包埋块保存时间的长短对结果影响不大。
常规固定（多数用福尔马林）、石蜡包埋的组织块均可用于流式细胞术，但含苦味酸或汞的固定液均不宜使用。切片厚度以30～50微米为宜。切片脱蜡要干净、彻底，否则制备出的细胞悬液中碎片多，影响测定。梯度酒精水化后用胃蛋白酶或胰蛋白酶消化，消化后镜检呈单个分散状态；由于福尔马林固定可使DNA和核蛋白产生共价交联，影响DNA和染料的化学定量结合，导致荧光强度下降，蛋白酶可破坏其联结，改善测定的组方图质量，消化时间以能分散细胞及细胞碎片尽量少为适度，以100目尼龙筛网滤去未消化完的组织片，离心去上清液后，加入冰冷的70%酒精固定，放入4℃冰箱备用。上机前染色。DNA特异荧光染料主要有：（1）碘化丙锭（PI）；（2）溴化乙锭（EB）；（3） 4，6-二脒基-二苯基吲哚（DAPI）。FCM检测石蜡包埋组织细胞DNA含量可做为以形态学为基础，多参数综合诊断中的一个重要的新手段。由于仪器设备价格昂贵及制备样品的诸多环节均可能影响测定的数据，限制了临床的广泛使用。
石蜡切片标本是形态计量技术的基础 形态计量技术是近年发展起来的一种新的定量检测技术，用全自动图像分析仪对组织和细胞内各种有形成分的数量、体积、长度及表面积等的图像数据进行数学处理，以便对生物组织细胞及其结构成分的形态进行定量分析，如线粒体个数、内质网、细胞核及胞质面积、胰岛的数量及各类细胞的数值、肾小体的数量和体积比以及Feulgen染色测定细胞核DNA原位定量等，使组织学及细胞学的研究由形态及定性观察转向形态定量化。形态计量是从石蜡组织切片或涂片以及组织的光镜照片和电镜照片上的各种结构获取二维图像数据，通过软件程序处理，得出有价值的结构参数。这种数据准确性高、客观性强、重复性好、可减少或弥补观察者的主观性差异。形态计量已应用于临床病理诊断工作，包括非肿瘤病变与肿瘤病变。国内对非肿瘤性病变的研究已涉及到动脉粥样硬化、肝硬变、前列腺肥大、克汀病、胰腺炎及精索静脉曲张等；而对肿瘤病变的研究则是形态计量学在临床研究的重点，目前较集中于消化道、肝、膀胱、乳腺和肺等器官的肿瘤。此外，在疾病的发生过程中把形态计量参数与功能变化指标有机地结合，有利于探讨疾病的发病机制；形态计量参数对肿瘤病变的治疗效果及预后判断的估计亦有参考价值。
在形态计量学的研究中，首先是对样品质量要求较高，例如制片过程中组织的收缩、膨胀与挤压、切片厚度与方向，特别是切片染色技术，染色是使组织或细胞各成分能染成不同色泽而便于识别，提高待测成分图像的可测性及其内在组分的表达性，使待测成分的色彩和亮度明显清晰地区别于它的背景。采用常规染色、特殊染色以及免疫组织化学染色，可对不同着色的成分及反应物作形态定量测定；利用免疫组织化学和原位杂交技术使病灶染色，再作形态定量测量。其次是要找出特征结构参数或定量指标，可先检测组织或细胞的各种可测参数或根据待测成分的形态特点设计一些参数，再用统计学方法筛选出有用的参数作定量测定。由于仪器昂贵，目前国内尚处在实验研究阶段，临床上的广泛应用尚有一定困难。形态计量技术与常规技术和其它新技术综合研究方法的使用，具有较好的应用价值及效果。
随着各种新仪器的问世和新技术方法的不断建立与使用，石蜡切片技术也逐渐扩展、渗入许多新领域中，做为基础技术提供有效的实验或使用样品。石蜡包埋组织切片还可用于细胞原位核酸分子杂交技术中，可对材料中被杂交的DNA分子进行定位、含量分析或观察基因表达（mRNA）水平；聚合酶链式反应（PCR）技术可用于固定、石蜡包埋组织的DNA分析，使研究进入了分子水平，但在短期内这些技术尚不能做常规使用。

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宽城区19267518102： 请问眼球的石蜡切片和冰冻切片有什么区别?各有什么优缺点? - ？
戊全富山： 1.冰冻切片 是免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法.其最突出的优点是能够较完好地保存多种抗原的免疫活性,尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片.新鲜的组织及已固定的组织均可作冰冻切片.冰冻时,组织中水份易形成冰晶,往...

宽城区19267518102： 免疫荧光技术为什么要使用冰冻切片 - ？
戊全富山： 只有新鲜切片才能荧光染色,这样子做出来的数据才比较准确哈,所以选择用冰冻是最大程度与上选用材料

宽城区19267518102： 石蜡切片免疫荧光与免疫组化一抗浓度有区别吗 - ？
戊全富山： 免疫荧光的一抗浓度一般高于免疫组化的一抗浓度,但是也要看具体情况: 因此免疫荧光一般采取二步法,而免疫组化中有biotin放大这一步.所以建议免疫荧光的时候重新摸索浓度,要是采用三步法可能不需要摸索了.另我们免疫荧光抗体一般用推荐浓度. 免疫荧光抗体浓度要根据免疫组化结果的强弱调整,如果较强,用相同浓度即可;如果组化阳性较弱,那么做荧光时要加大抗体浓度.至于免疫组化的抗体是否能做免疫荧光,其实是由组织类型及标本的固定方式决定的.一般组化为石蜡切片,荧光为冰冻切片或细胞爬片.如果组化和荧光用的是相同的标本,那么抗体就能通用,毕竟组化和荧光的区别在于一抗的呈现方式,而非抗原抗体的结合.

宽城区19267518102： 现代生物学研究中石蜡制片技术的应用有哪些? - ？
戊全富山： 荧光标记法、细胞培养、细胞杂交技术、石蜡切片技术、制片技术(包括临时装片和永久装片)等等.希望对你有帮助.

宽城区19267518102： 微波石蜡切片免疫荧光多重标记在病理诊断有哪些优势? ？
戊全富山： 冰冻组织免疫荧光多重标记存在切片厚、组织细胞结构重叠、共表达抗原弥散、定位不准 确、不能同时与光镜对照观察、标本不能长期保存,不利于进行回顾性研究等固有缺点.与传 统的冰冻组织免疫荧光法相比,石蜡切片免疫荧光多重标记结果显示切片薄、组织结构更清 晰、共表达抗原定位更准确,石蜡包埋组织允许存档以及稍后进行慢慢回顾评价,且在进行免 疫荧光法检测的同时还可以进行光镜检测观察,但在冰冻组织免疫荧光检测中则无法达到这 样好的组织结构与免疫沉积之间的相关性.

宽城区19267518102： 做间接法免疫荧光染色,如何设置对照? - ？
戊全富山： (1)空白对照:如果你做的是石蜡切片免疫组化,这个对照必须有,目的是看自发荧光,脱蜡后直接在荧光显微镜下观 察.

宽城区19267518102： 简述envision法的操作步骤 - ？
戊全富山： (1)4弘m常规石蜡切片经烤片后,常规二甲苯、乙醇脱蜡至水,PBS洗3minX3次.(2)预处理组织切片(可用酶消化或AR或不作任何处理,依一抗质量而定).(3)PBS洗3rainX3次.(4)0.3%H202阻断内源性过氧化物酶15rain,PBS洗3rainX 3次.(5)适当稀释特异性一抗,37~C孵育几,PBS洗3minX3次.(6)EnVision复合物(即用型)孵育30min,PBS洗3minx3次.(7)水洗,复染,常规树胶封片.(8)结果观察.

宽城区19267518102： 谁有组织切片的制作过程 - ？
戊全富山： 一、制备显微标本的切片62616964757a686964616fe4b893e5b19e31333330323262法 一石蜡包埋切片制作法 这是最常用的切片法.以石蜡作为组织的填充支持介质,将整块组织加以包埋,最后凝固成均匀一致的固态结构.用切片机制取极薄...