血细胞涂片可以选用的固定液可以有哪些

制作血涂片过程中,为什么要使血膜迅速干燥，固定液的作用是什么~

注意事项：1、要制备良好的血细胞涂片，玻片必须干净。使用玻片时，只能手持玻片边缘，切勿触及玻片表面，以保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻。2、最好使用非抗凝血制备血涂片，也可用EDTA抗凝血制备。使用抗凝血标本时，应充分混匀后再涂片。抗凝血标本应在采集后4h内制备血涂片，时间过长可引起中性粒细胞和单核细胞的形态学改变。3、涂片的厚度、长度与血滴的大小、推片与载玻片之间的角度、推片时的速度等有关。一般认为血滴大、血粘度高、推片角度大、速度快则血膜厚，反之则血膜薄。4、血膜应厚薄均匀适度，头尾及两侧有一定的空隙。如血膜面积太小，可观察的部分会受到局限，故应以在离开载玻片另一端2cm的地方结束涂抹为宜。一些体积特大的特殊细胞常在血膜的尾部出现。5、血涂片必须充分干燥后方可固定染色，否则细胞尚未牢固地吸附在玻片上，在染色过程中容易脱落。

一、涂片前准备工作及涂片方法
1、涂片前准备工作
（1）保证标本新鲜，取材后尽快制片。
（2）涂片操作要轻巧，避免挤压以防止损伤细胞。涂片要均匀，厚薄要适度，太厚细胞堆叠，太薄细胞过少，均影响诊断。
（3）玻片要清洁无油渍，先用硫酸洗涤液浸泡冲洗，再用75%乙酸浸泡。
（4）含蛋白质的标本可直接涂片，缺乏蛋白质的标本，涂片前先在玻片上涂薄层粘附剂，以防止染色时细胞脱落，常用粘附剂为蛋白甘油，由等量生鸡蛋蛋白和甘油混合而成。
（5）每位患者的标本至少涂两张玻片，以避免漏诊。涂片后立即在玻片一端标上编号。
2、涂片制备方法
（1）推片法：用于稀薄的标本，如：血液、胸、腹水等。取离心后标本一小滴滴在玻片偏右侧端，推片用30度夹角将玻片上检液轻轻向左推。
（2）涂抹法：适用于稍稠的检液，如：鼻咽部标本。用竹棉签在玻片上涂布，由玻片中心经顺时针方向外转圈匀抹；或从玻片一端开始平行涂抹，涂抹要均匀，不宜重复。
（3）压拉涂片法：将标本夹于横竖交叉的两张玻片之间，然后移动两张玻片，使之重叠，再边压边拉，获得两张涂片。该法适用于较粘稠标本，如：痰液。
（4）吸管推片法：用滴管将标本滴在玻片一端，然后将滴管前端平行置于标本滴上，平行向另一端均速移动滴管即可推出均匀薄膜。此法亦适用于胸、腹水标本。
（5）喷射法：用配细针头的注射器将标本从左至右反复均匀地喷射在玻片上，此法适用于各种吸取的液体标本。
（6）印片法：将切取的病变组织用手术刀切开，立即将切面平放在玻片上，轻轻按印。此方法为活体组织检查的辅助方法。
二、涂片的固定
固定（fication）的目的是保持细胞自然形态，防止细胞自溶和细菌所致的腐败；固定液能沉淀和凝固细胞内蛋白质和破坏细胞内溶酶体酶，使细胞不但保持自然形态，而且结构清晰，易于着色。因此标本愈新鲜，固定愈及时，细胞结构愈清晰，染色效果愈好。
1、固定液：细胞学检查常用的固定液有下列三种：第一种乙醚酒清固定液：该固定液渗透明性较强，固定效果好，适用于一般细胞学常规染色；第二种是氯仿酒精固定液：又称卡诺氏固定液。其优点同上；第三种是95%酒精固定液，适用于大规模防癌普查。制备简单，但渗透作用稍差。
2、固定方法
（1）带湿固定：涂片后未待标本干燥即行固定的方法称带湿固定。此法固定细胞结构清楚，染色新鲜。适用于巴氏或HE染色。痰液、阴道分泌物及食管拉网涂片等常用此方法。
（2）干燥固定：涂片后待其自然干燥，再行固定。适用于稀薄标本如尿液、胃冲洗液等，也适用于瑞特染色和姬姆萨染色。
3、固定时间：一般为15-30min。含粘液较多标本，如痰液、阴道分泌物、食管拉网等固定时间应适当延长；尿液、胸、腹水等涂片不含粘液，固定时间可酌情缩短。
三、涂片的染色
1、染色的目的和原理：染色的目的是借助于一种或多种染料，使组织和细胞内结构分别着不同的染色，这样在显微镜下能清楚地观察细胞内部结构，作出正确判断。
组织细胞染色原理至今尚无满意的解释，可能是物理作用，也可能是化学作用，或者是两者综合作用的结果。
染色的物理作用是利用毛细管现象，渗透、吸收和吸附作用，使染料的色素颗粒牢固地进入组织细胞，并使其显色；染色的化学作用是渗入组织细胞的染料与其相应的物质起化学反应，产生有色的化合物。
各染料都具有两种性质，即：产生颜色；征收被组织形成亲和力。这两种性质主要由发色基因和助色基因所产生。发色基团：苯的衍生物具有可见光区吸收带。这些衍生物显不出吸收带与其价键的不稳定性有关，如对苯二酚为无色，当其氧化后失去两个氢原子，它的分子或则变为有黄色的对醌，这种产生颜色的醌式环称为发色基团。若一种化合物含有几个环，只要其中有一个醌式环就会发出颜色，称此发色基团为色原（chromogen）。助色基团：是一种能使化合物以生电离作用的辅助原子团（酸碱性基团）。它能使染色的色泽进一步加深，并使其与被染色组织具有亲和力。
助色基团的性质决定染料是酸性碱性。碱性染料具有碱性助色基团，在溶媒中产生的带色部分为带正电荷的阳离子，吻与组织细胞内带负电荷的物质结合而显色。如细胞核内的主要化学成分脱氧化核糖核酸易被苏木素染成紫蓝色，称嗜碱性。酸性染料具有酸性用力色基团，在溶酶中产生带色部分为阴离子，易与组织细胞内带正电荷部分结合而显色，此性质被称为嗜酸性，如细胞浆内订成分为蛋白质，易与伊红或橘黄结合呈红色或橘黄色。
2、常用染色方法：临床日常工作中较为常用的染色方法有下列3种：
（1）巴氏染色法：本法染色特点是细胞具有多色性颜色，色彩鲜艳多彩。涂片染色的透明性好，胞质颗粒分明，胞核结构清晰，如鳞状上皮过度角化，细胞质呈橘黄色；角化细胞显粉红色；而角化前细胞显浅绿色或浅蓝色，适用于上皮细胞染色或观察阴道涂片中激素水平对上皮细胞的影响。此方法的缺点是染色程序比较复杂。
（2）苏木精—伊红（he

1、95%酒精：
　　是最常用的细胞学固定液，能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，但核蛋沉淀后，能溶于水，因此，经95%酒精固定的涂片，染色前没有必要经过水洗。此固定液适用于苏木素-伊红染色和巴氏染色。固定时间根据标本的不同，时间也不尽相同，一般标本固定时间为15-30分钟，痰标本需要更长一些时间。经过95%酒精固定的标本，细胞核保存较好，结构清晰，颜色鲜艳。如果在95%酒精液内加入聚乙二醇更佳，可以保护细胞免受空气干燥后的人工假象。
2、乙醚酒精液（1：1）：
　　其效果与95%酒精相似，但由于乙醚有很强的吸水性和特有的刺激性气味，容易挥发，长期低浓度吸入，有头痛、头晕、疲倦、嗜睡、蛋白尿、红细胞增多等不良反应。长期皮肤接触，可发生皮肤干燥、皲裂。所以现在已经逐渐被95%酒精所代替。
3、甲醇：
　固定时间快，细胞收缩小，细胞核保存较好，结构清晰，染色鲜艳。常作为穿刺细胞涂片的固定液。对抗原保存较好，可作为细胞涂片免疫组化的固定液。缺点是具有挥发性和毒性，大量接触与吸入对中枢神经有一定的伤害。甲醇的毒性与其代谢产物甲醛和甲酸的蓄积有关。以前认为毒性作用主要为甲醛所致, 甲醛能抑制视网膜的氧化磷酸化过程,使膜内不能合成ATP,细胞发生变性,最后引起视神经萎缩。近年研究表明,甲醛很快代谢成甲酸,急性中毒引起的代谢性酸中毒和眼部损害，主要与甲酸含量相关。
4、冰醋酸：5%水溶液可作固定用。不能沉淀白蛋白，但能沉淀核蛋白。渗透性强，固定快，能使红细胞膨胀而破碎，常与其它液体配合使用。
4、无水酒精：
　对糖原保存较好，容易使细胞收缩，其性能与95%酒精相似，很少单独使用，一般只用于糖原的固定。
5、丙酮：
　为易挥发的无色液体，有刺激性气体。可使蛋白质沉淀，渗透性强，细胞收缩严重，对核的固定差。很少用于常规细胞学的固定。广泛用于酶组织化学中的各种酶的固定，也有人用于抗原的保存，作为细胞涂片免疫组化的固定液。丙酮具有挥发性和毒性，大量接触与吸入对肝、肾及中枢神经有一定的伤害。
6、Carnoy 固定液
配方：无水乙醇60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml。
　　Carnoy液能固定胞浆和胞核，尤其适宜于染色体等。常用于糖原及尼氏体的固定，由于冰醋酸能溶解红细胞并可防止细胞由酒精引起的过渡收缩，对固定有血的标本和显示DNA、RNA效果很好。缺点是每次固定后固定液内有大量的红细胞碎片和细胞脱落，必须及时过滤，否则容易造成污染。其次，氯仿具有挥发性和毒性，大量接触与吸入对肝、肾及中枢神经有一定的伤害。
7、10%中性缓冲甲醛液：
固定液配方1：40%甲醛10ml，0.01mol/L pH7.4的PBS90ml。
固定液配方2：40%甲醛120ml，蒸馏水880ml，磷酸二氢钠（NaH2PO4•H2O）4g，磷酸氢二钠（Na2HPO4）13g。
　　10%中性缓冲甲醛液对大多数抗原保存较好，是免疫组织化学最常用的固定液，组织穿透性好，组织收缩较小。但此液体不适合固定湿固定的涂片，可作为干固定涂片和细胞蜡块的固定液。甲醛也具有挥发性和毒性。大量吸入会出现呼吸道的严重刺激和水肿、眼刺痛、头痛，也可发生支气管哮喘。经常吸入少量甲醛，能引起慢性中毒，出现粘膜充血、皮肤刺激症、过敏性皮炎、指甲角化和脆弱、甲床指端疼痛等。全身症状有头痛、乏力、胃纳差、心悸、失眠、体重减轻以及植物神经紊乱等。

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