分子生物学方面的问题-----关于lac启动子 :)
GFP基因的克隆就是把GFP基因PCR扩增出来,再通过酶切、连接的过程,把GFP基因连接到特定载体上,然后再转化涂板。阳性转化子就是连接成功的克隆(就是你想得到的克隆)。鉴定的方法比较简单常用的就是菌落PCR。挑取单菌落PCR后电泳,看条带的大小是否正确,如果正确再送测序。你的电泳图就是看PCR的条带大小和目的产物的大小是否一致。
operator是操纵基因,operon是操纵子。操纵基因、启动基因和结构基因共同组成一个单位——操纵子(operon)。
Lac启动子:它来自大肠杆菌的乳糖操纵子,是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列,由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。Lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过CAP(catabolite gene activation protein)因子和cAMP来激活启动子,促使转录进行。负调控则是由调节基因产生LacZ阻遏蛋白,该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如IPTG可与阻遏蛋白形成复合物,使其构型改变,不能与O基因结合,从而解除这种阻遏,诱导转录发生。在讲些相关知识:启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列,它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子,基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子,因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。
原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成,对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5~10 bp处,有一段由6~8个碱基组成,富含A和T的区域,称为Pribnow 盒,又名TATA 盒或-10区。来源不同的启动子,Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp处,有一段由10 bp组成的区域,称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s亚基结合,-10区与RNA聚合酶的核心酶结合,在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链,RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键,以后在RNA聚合酶作用下向前推进,形成新生的RNA链。
原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。
启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列,它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子,基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子,因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。
原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成,对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5~10 bp处,有一段由6~8个碱基组成,富含A和T的区域,称为Pribnow 盒,又名TATA 盒或-10区。来源不同的启动子,Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp处,有一段由10 bp组成的区域,称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s亚基结合,-10区与RNA聚合酶的核心酶结合,在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链,RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键,以后在RNA聚合酶作用下向前推进,形成新生的RNA链。
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SD序列
1974年Shine和Dalgarno首先发现,在mRNA上有核糖体的结合位点,它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3~10 bp处的由3~9 bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸,刚好与16S rRNA 3¢末端的富含嘧啶的序列互补,是核糖体RNA的识别与结合位点。以后将此序列命名为Shine-Dalgarno序列,简称SD序列。它与起始密码子AUG之间的距离是影响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一,某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合,从而影响蛋白质的翻译。另外,真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG之后,才能产生一个完整的蛋白质。
终止子
在一个基因的3¢末端或是一个操纵子的3¢末端往往有特定的核苷酸序列,且具有终止转录功能,这一序列称之为转录终止子,简称终止子(terminator)。转录终止过程包括:RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进,RNA的延伸也停止在终止信号上,完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来。对RNA聚合酶起强终止作用的终止子在结构上有一些共同的特点,即有一段富含A/T的区域和一段富含G/C的区域,G/C富含区域又具有回文对称结构。这段终止子转录后形成的RNA具有茎环结构,并且有与A/T富含区对应的一串U。转录终止的机制较为复杂,并且结论尚不统一。但在构建表达载体时,为了稳定载体系统,防止克隆的外源基因表达干扰载体的稳定性,一般都在多克隆位点的下游插入一段很强的rrB核糖体RNA的转录终止子。
你还是没太明白lac operon的结构,你是不是看到的老版本的书,建议你去gene8上查一查具体内容。
还有,启动子是promotor, 原版书上是lac operon。
不大可能吧,它调控编码的repressor是不是也能和其他细菌的位点结合?那么凑巧的构象吻合不大可能。
你可以再参考一下阿拉伯糖的调控。
这是楼主的马甲,上面各位说的这些基本知识我明白,其实我的问题很简单,来源于大肠杆菌乳糖操纵子的Lac启动子(含有-35。 -10和阻遏物结合区等必要结构)是一个很强的启动子,那么在其它的细菌中它是否也具有强的启动子活性,是否受阻遏?以假单胞菌为例吧,谢谢!
在这里三言两语很难讲清楚,建议你还是看看相关专业书,或是当面找老师问问。
我想应该就像你说的那样的。
具体我也没做过,您再听一听其他人的观点。
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