请教ANNEXIN V-PI法检测凋亡的原理和相关试剂盒使用步骤
博凌科为生物科技-为你解答：一、原理在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依 赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（EGFP、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。二、常见试剂盒组份 组份 Annexin V-FITC 50L 100L 250L 500L Binding Buffer 5 mL 10.0 mL 25 mL 25 mL2 Propidium Iodide （PI） 50L 100L 250L 500L 三、操作步骤1.悬浮细胞离心（2000rpm离心5min）收集；贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集（注：胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性）；2.用PBS洗涤细胞二次（2000rpm离心5min）收集1~5105细胞；3.加入500L的Binding Buffer悬浮细胞；4.加入5L Annexin V-FITC混匀后，加入5L Propidium Iodide，混匀；5.室温、避光、反应5～15min；6.请在1 hour内，进行下述荧光显微镜或流式细胞仪的观察和检测。A.荧光显微镜观察1.滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞；2.对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡；（1） 将细胞于盖玻片上生长，用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡，并设立阴性对照组；（2） 用PBS洗涤细胞两次；（3） 在500L 的Binding Buffer中加入2L Annexin V-FITC， 5L Propidium Iodide，混匀；（4） 将上述溶液滴加于盖玻片表面，使长有细胞的盖玻片表面均匀覆盖；（5） 避光、室温反应5 min。3.将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下、双色滤光片（FITC和罗丹明）观察Annexin V-FITC荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色。B.流式细胞仪分析用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488 nm; 发射波长Em=530 nm。荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。四、注意事项1.Annexin V-FITC，Propidium Iodide （PI）避光保存及使用。2.Propidium Iodide （PI）有毒，操作时要戴手套。3.本试剂盒适用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不以应低于1105，，不适用于检测组织样本。4.推荐使用悬浮培养细胞，如果是贴壁细胞，用胰酶消化不当，会引起假阳性，而用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存在含2%BSA的PBS中，防止进一步的损伤。5.因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。五、储存 置于40C，可保存一年
是的，要注意不要消化过度
有关Annexin -PI凋亡细胞的检测使用的是BIODAI的较多，具体的步骤如下：1) 悬浮细胞：300g，4℃，离心5min，收集细胞。贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300g，4℃，离心5min，收集细胞。胰酶消化时间不宜过长(见注意事项)，以防引起假阳性。2) 用预冷的PBS洗涤细胞两次，每次均在300g，4°C离心5min，收集1-5×105细胞。注意:在洗涤细胞时，尽量避免损伤细胞。3) 加入100µl 1×Binding Buffer重悬细胞。4) 加入5µl Annexin V-FITC和5µl PI，轻轻混匀。 5) 避光、室温反应10 min。6) 加入400µl 1 x Binding Buffer，混匀，样品在1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit）是用FITC标记了的Annexin V作为探针，来检测细胞早期凋亡的发生，可用荧光显微镜、流式细胞仪或其他荧光检测设备进行检测。
其检测原理为：在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡的细胞中，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。
操作步骤：
1. 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2. 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3. 样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。
4. 除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
称生尚尔： 博凌科为生物科技-为你解答:用流式检测凋亡时,PI受时间的影响很大,因标记了PI后会加大细胞毒性,随着时间延长会导致PI的染色增加,特别是检测早期凋亡时,如果时间延长 除了会导致在流式细胞仪上的细胞分群差距加大外,误差会明显...
柳林县13493879955： 请教ANNEXIN V - PI测凋亡前,贴壁细胞的消化方法 - ？
称生尚尔： 博凌科为生物科技-为你解答:因为AnnexinV是Ca依赖的蛋白,所以不能加入EDTA, 防止EDTA螯合了Ca离子从而影响annexinV,进而影响结果.所以可以用不含EDTA的胰酶,放入温箱内进行消化,时间可以长一点,随时观察细胞情况,避免消化过度.建议用细胞刮子把细胞刮下来,然后用枪吹匀,比消化还简单,而且也避免了胰酶带来的损伤,机械的损伤还是很小的因为细胞大多呈大片大片地被刮下来.
柳林县13493879955： ANNEXIN V - PI测凋亡,贴壁细胞的固定方法? - ？
称生尚尔： 做Annexin V及PI染色不能够固定细胞.因为固定的实验操作实际上会杀死细胞,所以不能够用于关于细胞调亡的检测.经过固定的细胞,将会对Annexin V和PI同时呈现强染色,给你假阳性结果.所以你的时间点多也只好辛苦一点了.只有在每个时间点用活细胞染色,并且染色后一个小时内一定要检测记录好实验结果,不然时间拉长,细胞离开培养皿后逐渐调亡,染色会逐渐增强,还是给你假阳性.为了比较多个时间点,在分批操作上得多费心保持步骤和时间的一致了.为了保险,最好给每个时间点设置一个对照组.
柳林县13493879955： Annexin V和PI法检测凋亡细胞,此细胞在检测前应该怎么处理? - ？
称生尚尔： Annexin V和PI法检测凋亡细胞更适合于流式检测.如果没有流式,最后做成滴片用显微镜观察也可以.不用固定,直接洗两次就OK了.如果你不能确定,可以多找几家公司的说明书看一看. 一般来说,这个并不推荐石蜡切片.
柳林县13493879955： 细胞转染后带cy3红色荧光,可否用Annexin V 和 PI进行流式检测?可否把PI换成其他的染料?是否有其他的办法解决?若培养细胞中加入抗生素,在单位用... - ？
称生尚尔：[答案] PI肯定不行了 你是要做凋亡么 那就没办法了吧 Annexin 倒是可以用 如果是想染核的话还可以用DAPI 蓝色 加抗生素对细胞状态肯定有影响的 不过你只要保证要么一直加抗生素要么一直不加 不会对结果有大的影响
柳林县13493879955： 细胞凋亡的早期检测方法有哪些 - ？
称生尚尔： 1、PS(磷脂酰丝氨酸)在胞外膜分布的检测 PS从胞膜内侧转移到外侧现象是在细胞凋亡的早期即可发生标志.AnnexinV是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白,能专一性的结合暴露在胞膜外侧的PS,使用荧光素标记的AnnexinV 蛋白(如Annexin ...
柳林县13493879955： 流式细胞用annexin v测死活细胞污染色细胞有什么用 - ？
称生尚尔： 你的阴性对照就是无任何染色的细胞. PI阳性对照,可以固定过的死细胞,可以保证都是PI阳性 Annexin阳性的细胞,用trypsin消化时间长一点(比如消化10分钟),大部分也是阳性的.这个也从一个侧面反映出该方法(Annexin V+PI)的非特异性很高. 上机先用阴性对照设置PMT的电压和gate.再用PI和Annexin单染的阳性细胞调节compensation.然后就可以检测双染的样本了.
柳林县13493879955： 检测细胞凋亡AV - PI双染的具体步骤是怎样的?注意事项有哪些? - ？
称生尚尔： 除了上述的操作步骤,还有一个必须注意的,就是对照.阴性对照,阳性对照,还有调节通道的,只加PI,只加AV,这些都要设计好,要不测出来的值不可信. 细胞接种后,每日计数细胞数,连续观察7-10日,在对数坐标纸上绘制细胞生长曲...
柳林县13493879955： 请问流式细胞仪检测细胞凋亡的原理是什么? - ？
称生尚尔： 一、原理 在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧,而在细胞凋亡早期,细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧.Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸有高...
柳林县13493879955： 求助诱导细胞凋亡,Annexin - ？
称生尚尔： 1、必须活细胞检测,不能用能破坏细胞膜完整性的固定剂和穿透剂固定或穿膜. 2、特殊细胞的染色方法:在消化或吹打时,有些细胞(如神经元细胞)很容易受到损伤,导致晚期凋亡或坏死比例非常高,不能反映真实结果.实验的解决方法:先...
