融合PCR的操作原理及注意事项
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
实验操作注意事项
1、戴一次性手套,若不小心溅上反应液,立即更换手套。
2、使用一次性吸头,严禁与PCR产物分析室的吸头混用,吸头不要长时间暴露于空气中,避免气溶胶的污染。
3、避免反应液飞溅,打开反应管时为避免此种情况,开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上,应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面。
4、操作多份样品时,制备反应混合液,先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后分装,这样即可以减少操作,避免污染,可以增加反应的精确度。
5、最后加入反应模板,加入后盖紧反应管。
6、操作时设立阴阳性对照和空白对照,即可验证PCR反应的可靠性,又可以协助判断扩增系统的可信性。
7、尽可能用可替换或可高压处理的加样器,由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染,最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器,至少PCR操作过程中加样器应该专用,不能交叉使用,尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区。
8、重复实验,验证结果,慎下结论。
扩展资料
融合PCR技术( fusion PCR)采用具有互补未端的引物,形成具有重叠链的PCR产物,通过PCR产物重叠链的延伸,从而将不同来源的任意DNA片段连接起来,此技术在不需要内切酶消化和连接酶处理的条件下实现DNA片段的体外连接,为同源重组片段的构建提供了快速简捷的途径。
标准的PCR过程分为三步:
DNA变性:(90℃-96℃):双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA。
退火:(60℃-65℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。
延伸:(70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右,活性最佳)的作用下,以dNTP为原料,从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸,合成与模板互补的DNA链。
参考资料来源:百度百科-PCR
PCR技术的原理是什么?
PCR原理:DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链,在DNA聚合酶的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应...
PCR技术的基本原理是什么?
PCR技术的基本原理:该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下,依靠于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板,借助一小段双链DNA来启动合成,通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合,形成部分双链。在适宜的温度和环境下,DNA聚合酶将脱氧单...
PCR原理是什么?
PCR(聚合酶链式反应)技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性→退火→延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮...
简述聚合酶链式反应(PCR)的原理和具体过程。
原理就是DNA半保留复制吧 过程只要记住 1.DNA变性(90℃-96℃):双链DNA模板在热作用下, 氢键断裂,形成单链DNA 2.退火(25℃-65℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。3.延伸(70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右,活性最佳)的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′端→3′...
什么是聚合酶链反应(PCR)?
聚合酶链反应(PCR)的基本原理是一种酶促合成反应。即在模板DNA、引物和脱氧核糖核苷酸存在下,在DNA聚合酶的作用下,使DNA链扩增延伸。试验先通过加热变性,使DNA双螺旋的氢链断裂,解离成单链DNA;然后通过退火,突然降温使引物与其互补的模板在局部形成杂交链;然后再在DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸...
PCR工作原理
以光电耦合式SSR为例,其工作原理可分为几个步骤:当无输入信号时,电路的状态是这样的:T3处于截止状态,T4则导通,VT1被关闭(其控制极保持在低电位)。然而,当有信号输入时,情况发生变化。T3开始导通,T4则截止。当电源电压超过过零电压(大约±25V),A点电压大于T5的发射极电压,使得T5导通。
pcr原理是什么?
PCR原理:DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链,在DNA聚合酶的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应...
pcr技术的原理是什么?
PCR技术的基本原理类似于DNA天然复制的一个过程,pcr技术的特异性主要是依赖于与靶序列的寡核苷酸引物。PCR技术其实是一种体外的DNA 产生扩增的技术,是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下,依赖于DNA聚合酶的酶促合反应,将需要被扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经过一系列反应的多次...
pcr的原理是什么
PCR原理是聚合酶链式反应,一种分子生物学技术,用于扩增特定的DNA片段。PCR原理的详细解释如下:PCR的基本构成与过程 PCR主要由三个基本步骤构成:变性、退火和延伸。在PCR过程中,DNA模板在热稳定聚合酶的作用下,通过不断重复这三个步骤,实现特定DNA片段的指数级扩增。变性与退火 在变性阶段,PCR反应...
PCR实验原理和操作步骤是什么?
实验方法原理 ①模板DNA的变性:模板DNA经加热至94℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应做准备;②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的...
天庭沙美: PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物. 实验操作注意事项 1、戴一次性手套,若不小心溅上反应液,立即更换手套. 2、使用一次性吸头,严禁与PCR产物分析室的吸头混用,吸...
双台子区13580238572: 在做pcr的操作过程中需注意哪些问题? - ?
天庭沙美: 原理:DNA双连复制 条件:已知目的基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA聚合酶 过程:DNA变性,氢键断开,成单链DNA 退火,形成局部双链 延伸 特点:成指数形式扩增
双台子区13580238572: 基因扩增的基因扩增 - PCR技术 - ?
天庭沙美: 多聚酶链式反应的原理类似于DNA的天然复制过程.在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物,经变性、退火和延伸若干个循环后,DNA扩增2n倍. 1.变性:加热使模板DNA在高温下(94℃)变性,双链间的氢键断裂而形...
双台子区13580238572: PCR技术原理与应用有哪些呢? ?
天庭沙美: 另外,两条引物之间避免有同源序列,尤为连续6个以上相同碱基的寡核苷酸片段,否则两条引物会相互竞争模板的同一位点;同样,引物与待扩增靶DNA或样品DNA的其它序列也不能存在6个以上碱基的同源序列
双台子区13580238572: 免疫PCR的基本原理和大致流程是什么 - ?
天庭沙美: 博凌科为-为你解答:免疫-PCR主要由两个部分组成.第一部分是类似于普通酶联免疫吸附实验(ELISA)的抗原抗体反应.第二部分即常规的PCR扩增和电泳检测.免疫-PCR与ELISA的区别就...
双台子区13580238572: PCR仪的内部构造及工作原理是什么? - ?
天庭沙美: 顶楼上,就是一个升温降温的机子.升降温速度越快,性能越好.PCR的工作原理是变性 退火 延伸 三个步骤,这三步需要不同的温度,而PCR仪就是能达到这样目的的一个装置
双台子区13580238572: RT - PCR原理及操作 - ?
天庭沙美: 原理:RT-PCR 为反转录RCR(reverse transcription PCR)和实时PCR(real time PCR)共同的缩写.逆转录PCR,或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR),是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形.在RT-PCR中,一条...
双台子区13580238572: 请教quantitative real - time PCR技术的具体操作步骤和注意事项 - ?
天庭沙美: 博凌科为生物科技-为你解答:注意事项:加入试剂之前,把它混匀一下,以免放置时间长了浓度不均.移液枪用完之后要归到最大计量的位置,防止久而久之弹簧失去弹性.多和大家讨论,同时多关注别人讨论的经验,这几乎是最快提高的捷...
双台子区13580238572: 反向 - PCR如何操作?
天庭沙美: 反向PCR在研究转座因子、反转录病及其他 能与基因组DNA整合或易位的DNA序列中有许多重要应用.这些应用包括序列的易位、 转座和基因融合,其中之一是已知序列,例如癌基因或免疫系统的基因组成.在所有 这些情况中,如已知序列插入未知序列或与未知序列并列,反向PCR可用于测定未知 边侧序列.反向PCR的主要优点是简单快速,可以研究许多独立克隆.其某些应用适 合于临床诊断. 反向PCR的局限之一是由未知边侧序列性质引起的,需用几种酶试验以选择产生大小合适的片段的内切酶.另一局限是许多常用内切酶也在不适当位点裂解载体序 列.但一旦确定合适的内切酶,反向PCR方法是直接了当和可靠的.