单细胞研究|| 利用 Illumina®技术的近期单细胞研究文献综述(数据分析)
作者&投稿：乾晴 （若有异议请与网页底部的电邮联系）
单细胞研究|| 利用 Illumina®技术的近期单细胞研究文献综述（应用二） ，主要介绍单细胞技术在药物发现、生殖健康、微生物生态学和进化、植物生物学、法医学、等位基因 – 特定基因表达方面的应用。
单细胞研究|| 利用 Illumina®技术的近期单细胞研究文献综述(样本制备)
单细胞测序带来数据分析的独特挑战单个哺乳动物细胞包含50,000–300,000个转录本，且各个细胞间的基因表达值存在显著差异。虽然每个单个细胞可表达数十万个转录本，但高达85%的转录本仅有1–100个拷贝。因此，在 scRNA-Seq 中捕获低丰度mRNA转录本并扩增合成的cDNA以确保所有转录本最终在文库中均匀呈现至关重要。
已知丰度的外参定量标准可帮助区分具有生物学意义的基因表达改变导致的技术变异性/噪声。分子索引也可校正测序偏差，而近期对自动样本处理的改进可进一步降低技术变异性。
DNA扩增和单细胞DNA-Seq技术的杂峰可通过使用专为此目的设计的计算算法来减少。本节着重描述一些单细胞测序数据分析方法（表 2）。
表2. 单细胞测序数据分析方法总结
参考文献
NGS常用于检测组织基因组DNA中的SNV，但是分析单细胞中的SNV易受到WGA相关杂峰的影响。为克服这一技术挑战，作者开发了单细胞多重置换扩增（SCMDA）以及相关的单细胞变异检出算法SCaller。在本研究中，作者从成纤维细胞克隆中分离了未扩增的基因组DNA。他们还从这些克隆中分离了单个细胞并使用 SCMDA 对单细胞基因组 DNA 进行了扩增。他们利用 HiSeq 2500 和 HiSeq X Ten 系统对经 SCMDA 扩增和未扩增的样本进行了全基因组测序，并使用SCaller对SNV进行了鉴定。通过比较来自单细胞和亲本克隆的SNV，作者证实他们的程序能准确分析单细胞基因组中的 SNV。
Illumina的技术：HiSeq 2500和 HiSeq X Ten 系统
单细胞基因组已为未培养微生物带来了大量单个基因组草图；但是，扩增步骤期间MDA杂峰导致覆盖不完整以及不均匀。元基因组学数据集不会发生相同序列偏移，但微生物群落的基因组复杂性妨碍了基因组草图的再现。在本研究中，作者研发了一种新的从元基因组学引导的、单细胞扩增基因组装数据生成种群基因组装的新方法。该研究通过完成海洋组1奇古菌门和SAR324类群浮游细菌的单细胞扩增基因组验证了该方法。SAR324类群基因组改进的方法组合揭示了存在多个单细胞扩增基因组中未发现的基因。
Illumina的技术：TruSeq LT Nano Kit、MiSeq系统
scRNA-Seq法提供了研究复合组织和疾病的无偏倚方法。但是，数据会发生高水平的技术噪声，并强烈依赖于表达程度。当基于重要生物学差异聚类细胞时，细胞间差异具有挑战性。例如，分割方法（包括k 均值聚类和BackSPIN算法）基于细胞周期分离细胞，而不是组织特异性信号。作者引入通路和基因集过离散分析 （PAGODA） ，通过检测已测量细胞可分类的所有重要的和潜在的重叠通路克服了该挑战。
Illumina的技术：HiSeq 2000系统
现代单细胞测序技术，尤其那些涉及大规模平行方法的技术，常会分离出受压、破碎或灭活细胞。这些低质量细胞可导致数据杂峰，且必须从分析中将其排除。在本研究中，作者提供了scRNA-Seq的首个工具，可以简单彻底的方式处理并移除低质量细胞。分析流程使用了 20 个高度组织的整合到机器学习算法中的生物学和技术功能集。作者在CD4+ T 细胞、骨髓树突状细胞和小鼠ESC上验证了该方法。方法还定义了视觉上无法检测的低质量细胞的新类型。
Illumina的技术：HiSeq 2000系统
scRNA-Seq数据集受固有技术噪声影响，不利于对细胞亚群的鉴定。为克服该困难以及影响基因表达异质性的未知隐藏因素，作者研发了一种模型（scLVM） ，以说明RNA-Seq数据集中未观察到的因素并使用单个小鼠ESC验证其模型。研究还是用HiSeq 2000系统在初始T细胞分化为TH2细胞过程中执行单个T细胞的RNA-Seq。研究将scLVM模型应用到T细胞RNA-Seq数据集并校正细胞周期基因表达。该研究能鉴定通过仅使用非线性 PCA 或 k 均值聚类无法发现的分化中 T 细胞的 2 个亚群。
Illumina的技术：Nextera XT DNA Sample Preparation Kit、HiSeq 2000系统
鉴定成分细胞类型对于了解给定器官或组织的功能至关重要。鉴定细胞类型的现有方法涉及基于特定标记成像和分离细胞，但是如果细胞类型稀有（如CSC或CTC）则该方法具有挑战性。在本研究中，作者使用HiSeq 2500 系统对数百个来自小鼠肠类器官的随机选定细胞执行 RNA-Seq。为鉴定类器官内的细胞亚群，研究研发了RaceID，一种在细胞符合群体中鉴定稀有细胞类型的计算方法。研究通过在取样的类器官细胞群鉴定单个激素生成细胞类型验证了该算法，并确定Reg4作为这些稀有肠道内分泌细胞的新标记。最后，研究使用 Reg4 捕获这些稀有细胞，以研究其遗传多样性，确定大量肠道内分泌细胞谱系。
Illumina的技术：HiSeq 2500系统
scRNA-Seq可在单个细胞群中捕获振荡动力学，并可发现大量测序试验中缺失的振荡。但是，连续RNA-Seq时期数列试验不可行，且对于大多数振荡系统可能无法同步化。先前已研发了Monocle254计算算法来在scRNA-Seq数据中通过几个不同时间点的数据拟时间排序解决该挑战。在本研究中，作者研发了Oscope，一种使用来自非同步细胞的scRNA-Seq数据确定并鉴定振荡基因的转录动力学的计算算法。研究通过将该模型应用到多种 scRNA-SeqIllumina 数据集（包括人 ESC）对 Oscope 进行了验证，且研究发现了与 Fluidigm C1 芯片上的捕获位点和输出孔位置相关的振荡模式。
Illumina的技术：Nextera XT DNA Sample Preparation Kit、HiSeq 2500系统
scRNA-Seq是一种发现新细胞类型、了解调控网络和重建发育过程的成熟方法。但是，scRNA-Seq通常涉及来自组织的分离细胞，因此破坏了其自然空间关系。为在scRNA-Seq数据中捕获空间关系，作者研发了Seurat，一种将较小的引导空间指定的“标志”基因集的scRNA-Seq与补充性原位杂交数据结合起来的计算策略。研究通过空间绘制从斑马鱼胚胎分离的851个单个细胞并创建空间模式的全转录组图对Seurat进行了验证。Seurat 可正确定位细胞的罕见亚群，并可绘制空间受限细胞以及表达模式更分散的细胞。
Illumina的技术：Nextera XT DNA Sample Preparation Kit、HiSeq 2500系统
Illumina的技术：HiSeq 2500系统
在分析单细胞DNA-Seq数据前，必须将DNA拷贝数异常与WGA杂峰区分开。该要求使得单细胞测序数据DNA拷贝数分析和单倍型分析有难度。在本研究中，作者研发了一种单细胞基因组分析法，可在单细胞全基因组确定单倍型和拷贝数——称为haplarithmisis的程序。方法解读单细胞的SNP等位基因片段，并将这些数据整合到计算工作流程中进行关联疾病变异的归因（siCHILD） 。作者通过对来自人体外受精胚胎的单个淋巴细胞和人分裂球确定单细胞基因组中带有疾病等位基因的单倍型验证了该方法。
Illumina的技术：TruSeq DNA LT Sample Preparation Kit、HumanCytoSNP-12v2.1 BeadChips、HiSeq 2000/2500系统
在单细胞DNA-Seq中，序列杂峰由必要的DNA扩增法引入，如MDA255和 MALBAC。256在本研究中，作者开发了一种新的统计方法，用于定量评估由于WGA产生的单细胞DNA扩增偏差。通过比较MDA和MALBAC DNA文库，研究提供由MDA和MALBAC生成的单细胞文库的基准比较，并还确定了扩增水平下基因组范围偏差的普遍特征。该研究的统计模型可校正单细胞 WGA 数据中的等位基因偏差。
Illumina的技术：MiSeq 和 HiSeq 2500系统
陆仲美安： 事实上,我们在所有qPCR数据分析中使用GenEx.GenEx强大、用户友好,且支持所有领先的qPCR仪器,这让从实验中导入数据和注释很简单.GenEx有着卓越的数据质量评估,对单细胞研究很重要,以及强大的单细胞表达谱工具.它有着用户友好的界面,即使是没有经验的用户也能使用那些强大的工具.
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陆仲美安： D.② ④ ⑤
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平塘县17820145595： 为什么要进行单细胞研究 - ？
陆仲美安： 为了研究单细胞情况下(而不是群体)的生命规律 或者 为了研究 某一个性状改变了的 单细胞及其后代的生命规律 总之,第一是为了纯化目的.
