细菌16S微生物多样性研究实验方法及关键点
1.1 样品元基因组抽提核心思想：
尽可能多的获得样本中各种微生物的基因组DNA。
1.2 样本元基因组提取的重要性：
最大程度获得样本中各种微生物的基因组DNA，为后续样本的分析和比较提供完整的微生物种类及丰度信息。否则，分析环节“形同虚设”，永远分析不出真实结果。
1.3 对样品的一些思考：
a）样本收集的难易程度；
b）样本的珍贵程度；
c）怎样用尽可能少的单个样本使用量来帮助客户完成研究目的；
d）怎样在实验开始前就确保客户结果的准确性；
e）复杂环境中的样本基因组如何能够更全面的获取。
1.4 元基因组提取的主要原理（核心步骤）：
①通过高温化学裂解法和物理击打法充分裂解细胞；
②离心法除去杂质、抑制物等；去除破碎细胞中的蛋白质；
③纯化DNA；
④消化RNA。
1.5 元基因组提取的主要流程：
1）样品准备：
样本-80℃保存；
避免样本出现反复冻融，影响样本中微生物组成，样本均在冰盒或干冰上完成拿取和转移。
2）化学裂解+物理击打
I.化学裂解：
作用：采用化学方式破坏细胞膜和细胞核膜充分释放细胞内容物。
II.物理击打：
作用：针对细胞膜难以裂解或裂解不充分的微生物，采用玻璃珠碰撞产生剪切力进行物理干预破坏；
材料：玻璃珠。
3）酚类及生物碱干扰物的去除
PVPP：
作用：
a）去除酚类和生物碱；
b）可参与配制适合的缓冲溶液反复浸提体系中的DNA，同时吸附杂质。
4）蛋白质、杂质、抑制剂干扰物的去除
HTR等试剂
纯化DNA；
Rnase A 消化RNA；
获得DNA溶液；
2. PCR文库扩增
2.1 高保真pfu酶的使用：
作用：
①降低扩增环节碱基错配率；
②校正作用；
③保真性大于Taq酶；
④产生平末端。
2.2 最低循环数的控制：
a）循环数对PCR扩增的影响：
1）降低扩增环节碱基错配率；
2）校正作用；
3）保真性大于Taq酶；
4）产生平末端。
b）解决方法：
1）根据样本来源及类型，利用预实验对扩增反应条件进行摸索，用最低的循环数获得满足后续实验浓度要求的扩增产物。
2）因样本间存在质量差异等情况，应保持每个样本扩增的循环数统一。
c）扩增DNA模板浓度的均一性
根据样本类型和来源，将扩增时样本DNA浓度调整至一致，以免由于样本DNA浓度差异造成扩增后产生偏差，增加样本间的可比性。
d）建库扩增循环数
1）采用扩增形式进行接头添加；
2）利用最低循环数确保完成建库。
3.实验过程质控
3.1 阴、阳性对照设置
1）元基因组提取环节：
①设置阳性对照，监控提取效果；
②设置阴性对照，监控提取流程。
2）PCR环节：
①设置阳性对照，监控扩增效果；
②设置阴性对照，监控PCR操作流程；
③扩增抽提环节阴性对照，监控抽提是否有污染；
④扩增抽提环节阳性对照，验证抽提效果。
4.数据分析优先级的确定
4.1 下机数据分析优先级：
1）分析阳性对照：观察实验、测序环节是否有问题；
2）比较分析不同测序run之间的阳性对照，排除测序批次间的差异性。
3）按照要求分析该批次中的样本。
微生物多样性(扩增子\/16S rDNA测序)—物种组成方法描述
一、物种组成分析内容及意义 a)物种相对丰度图 根据 OTU 注释结果分别在各个分类水平：domain（域），kingdom（界），phylum（门），class（纲），order（目），family（科），genus（属），species（种）统计各样品的物种相对丰度并作图（依据给定的物种比例分布表格）。含义：样品中包含何种物种...
微生物测序该怎么选,16S or 宏基因组?
目前来说，16S比较可靠的是用来做菌群的群落分析，物种的组成，多样性分析等，但是由于16S测序本身的性质，想要注释到种水平目前准确性还有待商榷。由于16s是以菌为主体进行研究，想要研究具体的功能目前来说还比较困难。2、宏基因组 宏基因组研究以环境中所有微生物基因组为研究对象，通过对环境样品中的...
微生物多样性中产生嵌合体可以避免吗
微生物多样性中产生嵌合体不可以避免。以细菌完成图为例。一般会在建库前对提供的菌株进行菌种鉴定，鉴定的方法通常是通过引物扩增出细菌的16S片段，通过一代测序获得该菌的16S序列，然后与NCBI数据库进行比对得到该菌株的信息，获得的信息确实是需要测定的菌株，只能说明没有其它细菌的污染，且前提是一代...
微生物16S测序数据分析思路解读
2）接着想看不同样本组间微生物群组成是否存在差异（对应于β多样性分析）；3）如果是，那么就有必要找出引起不同组样本微生物群差异的关键菌。如果不是，那说明微生物群比如肠道菌群与疾病或表型可能并不相关（基于已有的研究，这种可能性比较小）；4）找到了关键菌，在临床上，很自然会想到，这些（...
16s—α多样性分析(R画箱线图)
1、Simpson指数： 是生态学中常用的一个指数，它反映的是 优势种在群落中的地位和作用 ，若一个群落中优势种占的多，其他非优势物种所占的比例则会减少，那么Simpson 指数值较大，这说明群落多样性较低，该指数与其他多样性指数均呈 负相关 。2、Shannon指数： 用来估算样品中微生物的多样性指数之一...
为什么说正确理解菌株的含义对开展微生物学工作极为重要
因为微生物种类繁多，现在16s测序鉴定的菌种基本只到属的水平。而属下包涵很多种和亚种，每个属下的种和亚种的微生物各自又具有各自不同的特性和功能。即使是同一属下同一种的不同株的菌株也会具有相差甚远的特性和功能。因此，区别并了解菌株及其特性，对于相关工作很重要。希望能够有帮助。
代谢组学如何结合16S 测序与宏基因组测序
[代谢组学与 16S 的检测主要是物种类别或者丰度与代谢产物丰度的关联。而宏基因组与代谢组学的关联主要是其代谢通路与基因功能和代谢产物的关联。]1.由16S 测序与宏基因组测序得到微生物多样性和疾病相关的基因，不同疾病状态下是否有差异。[如何知道下图某疾病状态下哪种属细菌丰度高？如何找差异菌？]...
如何用pcr―dgge分析土壤样品中微生物的多样性
PCR-DGGE主要是扩增微生物的核糖体小亚基基因的可变区,如细菌的16S rDNA的V3区,通过变性梯度凝胶电泳可以将不同序列的DNA片段分离开来,不同位置的条带代表不同的微生物,条带切胶回收测序还可以知道是什么微生物.这种方法不仅可以比较不同土壤样品中微生物群落结构的差别,还可以粗略知道微生物群里结构的...
关于16sDNA问题
S中的S是一个沉降系数，亦即反映生物大分子在离心场中向下沉降速度的一个指标，值越高，说明分子越大。rDNA和rRNA中的小写字母r是ribosome(核糖体)的缩写。就用16s序列比对来初步判断微生物的种类。细菌提取基因组DNA后用27F和1492R引物做PCR，产物送去测序即可，序列测回来上NCBI比对即可。一株菌PCR...
为什么选择16SrRNA基因作为微生物进化的遗传标记?
1、16SrRNA基因每种微生物都有。2、16SrRNA结构和功能相对保守，在进化过程中变化相对较小。3、虽然相对保守，但在不同的微生物中，16SrRNA基因序列还是存在差异的，一般来说，16sRNA序列越接近，菌种亲缘关系越近，同源性越大；反之，16sRNA序列差异越大，同源性越小。
甄固迭力： 16s 是指16条序列(sequences)的缩写.在科学领域,这个术语通常用于描述基因组学研究中的一种分析方法.首先,16s序列是指细菌和古细菌中的16s rRNA基因序列.这个基因序列在细菌中高度保守,是细菌分类和进化研究的重要工具....
富民县17752015980： 宏基因组测序 找到16s相似序列吗 - ？
甄固迭力： 一、16S测序原理16SrDNA基因存在于所有细菌的基因组中,具有高度保守性.然而该基因序列还包括9个高变区(V1-V9),通过特异性引物对某一段高变区(如V3区)或某几段高变区(如V3-V4区)进行扩增测序,然后与数据库比对,可特...
富民县17752015980： 求教16SrDNA细菌鉴定方法 - ？
甄固迭力： 传统方法细菌做革兰氏染色 运动性试验 各种代谢 然后查伯杰氏细菌手册;用分子做的话提总DNA,pcr扩增16srDNA全长片段,上NCBI数据库比对,选择近缘序列构建系统发育树鉴定. 真菌的话主要根据形态,特别是有性型生殖形态鉴定
富民县17752015980： 如何用分子生物学的方法鉴定微生物 - ？
甄固迭力： 可以用16s rDNA的通用引物,对细菌的16s rDNA进行PCR, 然后测序,得到序列片段之后,在GenBank或者其他的数据网站进行比对,就可以得出微生物的种属.
富民县17752015980： 基因测序分析微生物菌群结构 NA是什么意思 - ？
甄固迭力： 基因测序分析微生物菌群结构 NA是什么意思 微生物群落测序是指对微生物群体进行高通量测序,通过分析测序序列的构成分析特定环境中微生物群体的构成情况或基因的组成以及功能.借助不同环境下微生物群落的构成差异分析我们可以分析...
富民县17752015980： 16S r DNA 全序列分析原理 - ？
甄固迭力： 16S r DNA是细菌系统分类学中最有用的和最常用的分子钟,存在于所有生物中,其进化具有良好的时钟性质,在结构和功能上具有高度的保守性,素有“细菌化石”之称.16S 大小适中,约1.5 kb左...
富民县17752015980： 标本中存在两种细菌16s rDNA 如何测序?？
甄固迭力： 可以通过培养细菌,根据两种细菌形态分离后再测 或者使用高通量都一次测后使用序列比对/回贴技术还原即可 不知道你的目的是什么,如果已知细菌的序列,可以通过设计特异的引物,分别扩增出细菌的基因,再对相应的产物进行测序 还有,其他没想到的方法等~
富民县17752015980： 以细菌16S rRNA基因作为细菌鉴定的理论依据是什么?简述其基本操作流程. - ？
甄固迭力： 原核生物的30S核糖体亚基中含有16S rRNA.16S rRNA的相对分子质量约为0.6 MDa,长度约为1540 nt.在30S核糖体亚基组装过程中,16S rRNA与其核糖体蛋白质S4、S7、S8、S15、S17和S20结合先行成初级复合物. 16S rRNA约有一半...
富民县17752015980： 高通量测序可以知道某一菌群的丰度吗 - ？
甄固迭力： 高通量测序技术在肠道菌群多样性研究中的应用 在人体肠道中生活着数以万亿的共生菌群,它们的种类繁多,可达上千种,数量也很惊人,是人体细胞总量的10倍以上,迄今为止,仍有80%以上的微生物不为人知.这些肠道微生物和人体存在...
富民县17752015980： 现在分析微生物群落结构还用pcr - dgge技术吗 - ？
甄固迭力： 现在分析微生物群落结构还用pcr-dgge技术 PCR-DGGE主要是扩增微生物的核糖体小亚基基因的可变区,如细菌的16S rDNA的V3区,通过变性梯度凝胶电泳可以将不同序列的DNA片段分离开来,不同位置的条带代表不同的微生物,条带切胶...
