以葡萄糖为底物的酶促反应，求齐全

酶促反应中的底物 底物是什么？ 底物对与酶活性的关系 底物的浓度对酶促反应的影响？~

酶促反应动力学（kinetics of enzyme-catalyzed reactions）：
酶反应动力学主要研究酶催化的反应速度以及影响反应速度的各种因素。在探讨各种因素对酶促反应速度的影响时，通常测定其初始速度来代表酶促反应速度，即底物转化量<5%时的反应速度。
1．底物浓度对反应速度的影响：
⑴底物对酶促反应的饱和现象：由实验观察到，在酶浓度不变时，不同的底物浓度与反应速度的关系为一矩形双曲线，即当底物浓度较低时，反应速度的增加与底物浓度的增加成正比（一级反应）；此后，随底物浓度的增加，反应速度的增加量逐渐减少（混合级反应）；最后，当底物浓度增加到一定量时，反应速度达到一最大值，不再随底物浓度的增加而增加（零级反应）。
⑵米氏方程及米氏常数：根据上述实验结果，Michaelis & Menten 于1913年推导出了上述矩形双曲线的数学表达式，即米氏方程： ν= Vmax[S]/(Km+[S])。其中，Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数。
⑶Km和Vmax的意义：
①当ν=Vmax/2时，Km=[S]。因此，Km等于酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度。
②当k-1>>k+2时，Km=k-1/k+1=Ks。因此，Km可以反映酶与底物亲和力的大小，即Km值越小，则酶与底物的亲和力越大；反之，则越小。
③Km可用于判断反应级数：当[S]100Km时，ν=Vmax，反应为零级反应，即反应速度与底物浓度无关；当0.01Km<[S]<100Km时，反应处于零级反应和一级反应之间，为混合级反应。
④Km是酶的特征性常数：在一定条件下，某种酶的Km值是恒定的，因而可以通过测定不同酶（特别是一组同工酶）的Km值，来判断是否为不同的酶。
⑤Km可用来判断酶的最适底物：当酶有几种不同的底物存在时，Km值最小者，为该酶的最适底物。
⑥Km可用来确定酶活性测定时所需的底物浓度：当[S]=10Km时，ν=91%Vmax，为最合适的测定酶活性所需的底物浓度。
⑦Vmax可用于酶的转换数的计算：当酶的总浓度和最大速度已知时，可计算出酶的转换数，即单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。
⑷Km和Vmax的测定：主要采用Lineweaver-Burk双倒数作图法和Hanes作图法。
2．酶浓度对反应速度的影响：当反应系统中底物的浓度足够大时，酶促反应速度与酶浓度成正比，即ν=k[E]。
3．温度对反应速度的影响：一般来说，酶促反应速度随温度的增高而加快，但当温度增加达到某一点后，由于酶蛋白的热变性作用，反应速度迅速下降。酶促反应速度随温度升高而达到一最大值时的温度就称为酶的最适温度。酶的最适温度与实验条件有关，因而它不是酶的特征性常数。低温时由于活化分子数目减少，反应速度降低，但温度升高后，酶活性又可恢复。
4．pH对反应速度的影响：观察pH对酶促反应速度的影响，通常为一钟形曲线，即pH过高或过低均可导致酶催化活性的下降。酶催化活性最高时溶液的pH值就称为酶的最适pH。人体内大多数酶的最适pH在6.5～8.0之间。酶的最适pH不是酶的特征性常数。
5．抑制剂对反应速度的影响：
凡是能降低酶促反应速度，但不引起酶分子变性失活的物质统称为酶的抑制剂。按照抑制剂的抑制作用，可将其分为不可逆抑制作用和可逆抑制作用两大类。
⑴不可逆抑制作用：
抑制剂与酶分子的必需基团共价结合引起酶活性的抑制，且不能采用透析等简单方法使酶活性恢复的抑制作用就是不可逆抑制作用。如果以ν～[E]作图，就可得到一组斜率相同的平行线，随抑制剂浓度的增加而平行向右移动。酶的不可逆抑制作用包括专一性抑制（如有机磷农药对胆碱酯酶的抑制）和非专一性抑制（如路易斯气对巯基酶的抑制）两种。
⑵可逆抑制作用：
抑制剂以非共价键与酶分子可逆性结合造成酶活性的抑制，且可采用透析等简单方法去除抑制剂而使酶活性完全恢复的抑制作用就是可逆抑制作用。如果以ν～[E]作图，可得到一组随抑制剂浓度增加而斜率降低的直线。可逆抑制作用包括竞争性、反竞争性和非竞争性抑制几种类型。
① 竞争性抑制：抑制剂与底物竞争与酶的同一活性中心结合，从而干扰了酶与底物的结合，使酶的催化活性降低，这种作用就称为竞争性抑制作用。其特点为：a.竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物；b.抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部位相同；c.抑制剂浓度越大，则抑制作用越大；但增加底物浓度可使抑制程度减小；d.动力学参数：Km值增大，Vm值不变。典型的例子是丙二酸对琥珀酸脱氢酶（底物为琥珀酸）的竞争性抑制和磺胺类药物（对氨基苯磺酰胺）对二氢叶酸合成酶（底物为对氨基苯甲酸）的竞争性抑制。
② 反竞争性抑制：抑制剂不能与游离酶结合，但可与ES复合物结合并阻止产物生成，使酶的催化活性降低，称酶的反竞争性抑制。其特点为：a.抑制剂与底物可同时与酶的不同部位结合；b.必须有底物存在，抑制剂才能对酶产生抑制作用；c.动力学参数：Km减小，Vm降低。
③ 非竞争性抑制：抑制剂既可以与游离酶结合，也可以与ES复合物结合，使酶的催化活性降低，称为非竞争性抑制。其特点为：a.底物和抑制剂分别独立地与酶的不同部位相结合；b.抑制剂对酶与底物的结合无影响，故底物浓度的改变对抑制程度无影响；c.动力学参数：Km值不变，Vm值降低。
6．激活剂对反应速度的影响：能够促使酶促反应速度加快的物质称为酶的激活剂。酶的激活剂大多数是金属离子，如K+、Mg2+、Mn2+等，唾液淀粉酶的激活剂为Cl-。

酶促反应动力学（kinetics of enzyme-catalyzed reactions）：
酶反应动力学主要研究酶催化的反应速度以及影响反应速度的各种因素。在探讨各种因素对酶促反应速度的影响时，通常测定其初始速度来代表酶促反应速度，即底物转化量<5%时的反应速度。
1．底物浓度对反应速度的影响：
⑴底物对酶促反应的饱和现象：由实验观察到，在酶浓度不变时，不同的底物浓度与反应速度的关系为一矩形双曲线，即当底物浓度较低时，反应速度的增加与底物浓度的增加成正比（一级反应）；此后，随底物浓度的增加，反应速度的增加量逐渐减少（混合级反应）；最后，当底物浓度增加到一定量时，反应速度达到一最大值，不再随底物浓度的增加而增加（零级反应）。
⑵米氏方程及米氏常数：根据上述实验结果，Michaelis & Menten 于1913年推导出了上述矩形双曲线的数学表达式，即米氏方程： ν= Vmax[S]/(Km+[S])。其中，Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数。
⑶Km和Vmax的意义：
①当ν=Vmax/2时，Km=[S]。因此，Km等于酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度。
②当k-1>>k+2时，Km=k-1/k+1=Ks。因此，Km可以反映酶与底物亲和力的大小，即Km值越小，则酶与底物的亲和力越大；反之，则越小。
③Km可用于判断反应级数：当[S]100Km时，ν=Vmax，反应为零级反应，即反应速度与底物浓度无关；当0.01Km<[S]<100Km时，反应处于零级反应和一级反应之间，为混合级反应。
④Km是酶的特征性常数：在一定条件下，某种酶的Km值是恒定的，因而可以通过测定不同酶（特别是一组同工酶）的Km值，来判断是否为不同的酶。
⑤Km可用来判断酶的最适底物：当酶有几种不同的底物存在时，Km值最小者，为该酶的最适底物。
⑥Km可用来确定酶活性测定时所需的底物浓度：当[S]=10Km时，ν=91%Vmax，为最合适的测定酶活性所需的底物浓度。
⑦Vmax可用于酶的转换数的计算：当酶的总浓度和最大速度已知时，可计算出酶的转换数，即单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。
⑷Km和Vmax的测定：主要采用Lineweaver-Burk双倒数作图法和Hanes作图法。
2．酶浓度对反应速度的影响：当反应系统中底物的浓度足够大时，酶促反应速度与酶浓度成正比，即ν=k[E]。
3．温度对反应速度的影响：一般来说，酶促反应速度随温度的增高而加快，但当温度增加达到某一点后，由于酶蛋白的热变性作用，反应速度迅速下降。酶促反应速度随温度升高而达到一最大值时的温度就称为酶的最适温度。酶的最适温度与实验条件有关，因而它不是酶的特征性常数。低温时由于活化分子数目减少，反应速度降低，但温度升高后，酶活性又可恢复。
4．pH对反应速度的影响：观察pH对酶促反应速度的影响，通常为一钟形曲线，即pH过高或过低均可导致酶催化活性的下降。酶催化活性最高时溶液的pH值就称为酶的最适pH。人体内大多数酶的最适pH在6.5～8.0之间。酶的最适pH不是酶的特征性常数。
5．抑制剂对反应速度的影响：
凡是能降低酶促反应速度，但不引起酶分子变性失活的物质统称为酶的抑制剂。按照抑制剂的抑制作用，可将其分为不可逆抑制作用和可逆抑制作用两大类。
⑴不可逆抑制作用：
抑制剂与酶分子的必需基团共价结合引起酶活性的抑制，且不能采用透析等简单方法使酶活性恢复的抑制作用就是不可逆抑制作用。如果以ν～[E]作图，就可得到一组斜率相同的平行线，随抑制剂浓度的增加而平行向右移动。酶的不可逆抑制作用包括专一性抑制（如有机磷农药对胆碱酯酶的抑制）和非专一性抑制（如路易斯气对巯基酶的抑制）两种。
⑵可逆抑制作用：
抑制剂以非共价键与酶分子可逆性结合造成酶活性的抑制，且可采用透析等简单方法去除抑制剂而使酶活性完全恢复的抑制作用就是可逆抑制作用。如果以ν～[E]作图，可得到一组随抑制剂浓度增加而斜率降低的直线。可逆抑制作用包括竞争性、反竞争性和非竞争性抑制几种类型。
① 竞争性抑制：抑制剂与底物竞争与酶的同一活性中心结合，从而干扰了酶与底物的结合，使酶的催化活性降低，这种作用就称为竞争性抑制作用。其特点为：a.竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物；b.抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部位相同；c.抑制剂浓度越大，则抑制作用越大；但增加底物浓度可使抑制程度减小；d.动力学参数：Km值增大，Vm值不变。典型的例子是丙二酸对琥珀酸脱氢酶（底物为琥珀酸）的竞争性抑制和磺胺类药物（对氨基苯磺酰胺）对二氢叶酸合成酶（底物为对氨基苯甲酸）的竞争性抑制。
② 反竞争性抑制：抑制剂不能与游离酶结合，但可与ES复合物结合并阻止产物生成，使酶的催化活性降低，称酶的反竞争性抑制。其特点为：a.抑制剂与底物可同时与酶的不同部位结合；b.必须有底物存在，抑制剂才能对酶产生抑制作用；c.动力学参数：Km减小，Vm降低。
③ 非竞争性抑制：抑制剂既可以与游离酶结合，也可以与ES复合物结合，使酶的催化活性降低，称为非竞争性抑制。其特点为：a.底物和抑制剂分别独立地与酶的不同部位相结合；b.抑制剂对酶与底物的结合无影响，故底物浓度的改变对抑制程度无影响；c.动力学参数：Km值不变，Vm值降低。
6．激活剂对反应速度的影响：能够促使酶促反应速度加快的物质称为酶的激活剂。酶的激活剂大多数是金属离子，如K+、Mg2+、Mn2+等，唾液淀粉酶的激活剂为Cl-。

脱氧葡萄糖醛酮还原酶的初步鉴定 目的：对从鸡肝脏中提取的3-脱氧葡萄糖醛酮还原酶进行初步鉴定。
方法：应用3-脱氧葡萄糖醛酮（3-Deoxyglucosone，3-DG）为底物的体外酶促反应体系，以辅酶NADPH的消耗反映提取得到的3-DG还原酶活性；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定所提取酶蛋白的分子量；TLC法鉴定体外酶促反应的还原产物。
结果：体外酶促反应：反应组剩余NADPH的OD值（0.649±0.107，n=3）明显低于空白对照组（0.795±0.002，n=3）（p<0.05），表明提取的3-DG还原酶具有一定的活性；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：显示两条蛋白质带，分子量分别为49kDa和180kDa，与文献比对，提示49kDa区带为3-DG还原酶；TLC法：酶促反应液中有两个斑点，与标准品比对，提示为3-DG（Rf值约0.6）和3-脱氧果糖（3-Deoxyfructose，3-DF）（Rf值约0.52）。
结论：可从鸡肝脏中提取得到含有活性的3-DG还原酶，其分子量约为49kDa，能催化其底物3-DG生成3-DF。可以选取鸡肝脏作为稳定获得3-DG还原酶的合适来源。
二、3-脱氧葡萄糖醛酮还原酶体外酶促反应体系中底物3-脱氧葡萄糖醛酮含量测定方法的建立
目的：建立3-DG还原酶体外酶促反应体系中底物3-DG的含量检测方法，以底物3-DG的消耗来反映3-DG还原酶活性。
方法：应用2，3-二氨基萘柱前衍生，采用C18反相色谱柱（4.6*250mm，5μm）为固定相，5mmol·L-1磷酸盐缓冲液（pH7.4）-甲醇-乙腈（70：5：25）为流动相，检测波长为Ex/Em=271/503nm的高效液相色谱条件，测定3-DG还原酶体外酶促反应体系中底物3-DG的剩余量；利用2，4-二硝基苯肼作为显色剂，采用紫外分光光度法测定3-DG还原酶体外酶促反应体系中底物3-DG的剩余量。
结果：采用RP-HPLC法，3-DG峰呈尖峰，分离较好（理论塔板数为6459）：在1～5μg·mL-1浓度范围内成线性（Y=332.40x+34.50，r=0.9992）：精密度RSD：1.2％（n=5）；重现性RSD：6.3％（n=6）；24h内的稳定性考察，其RSD为3.5％。平均加样回收率为77.17％，RSD为8.98％（n=5）。采用UV法：3-DG在5～70μg·mL-1范围内成线性（y=0.0098x-0.0005，r=0.9988）；精密度RSD：0.7％（n=6）；重现性RSD：3.6％（n=6）；平均加样回收率：109.93％，RSD：16.73％（n=6）；稳定性的考察，其OD值在1h内下降约50％。RP-HPLC法和UV法测定酶促反应体系中底物3-DG的含量，两种方法相关系数r=0.86887，具有显著相关（p<0.001）。
结论：建立了HPLC和UV二种检测3-DG还原酶体外酶促反应体系中3-DG含量的方法，为以底物3-DG的消耗反映3-DG还原酶活性提供了基础。
三、3-脱氧葡萄糖醛酮还原酶体外酶促反应体系最适条件、影响因素和评价范围考察
目的：对初步建立的3-DG还原酶体外酶促反应体系，进行各反应条件的优化，并考察相关因素对酶促反应体系的影响。
方法：用建立的RP-HPLC法检测酶促反应体系的3-DG含量，以单位时间内底物3-DG的消耗反映3-DG还原酶的活性，分别对反应体系中的辅酶NADPH浓度、3-DG还原酶酶量、底物3-DG浓度以及反应时间条件进行优化，并考察温度、pH、3-DG氧化酶、保存条件对3-DG还原酶活性的影响。
结果：辅酶NADPH浓度在0.15-0.25mg·mL-1之间，随着辅酶NADPH浓度的增加，3-DG的消耗量逐渐增加；当辅酶NADPH浓度达到0.25-0.30mg·mL-1之间，3-DG的消耗量较为平稳，接近平台。3-DG还原酶酶量在50-200μL时，3-DG消耗量与酶量的加入呈正比。当酶量超过200μL时，3-DG消耗量趋于平稳。底物3-DG浓度在50-400μg·mL-1下，3-DG的消耗量和3-DG的浓度成正比；3-DG的消耗率随之3-DG的浓度增加而降低。100μg·mL-1的3-DG浓度下，反应时间在60-120min内3-DG的消耗量较为稳定。3-DG的消耗量随着反应温度的升高而增加。3-DG的消耗量在pH7.4-7.9之间时最高，且较为稳定。3-DG还原酶体外酶促反应体系中，用NAD代替NADPH时，从鸡肝脏中提取的3-DG还原酶也能表达3-DG氧化酶活性，在提取纯化3-DG还原酶后即时测定3-DG还原酶活性，冻干酶粉的活性较液态条件下保存的酶活性较低。保存时间在30-180d内，随着保存时间的延长，3-DG消耗量降低。醛糖还原酶抑制剂（aldosereductaseinhibitor，ARI）依帕司他对3-DG还原酶有抑制作用，与反应组相比有显著性差异（p<0.001）；JZ01对3-DG还原酶活性有明显的增高作用（p<0.01）；槲皮素能部分抑制3-DG还原酶活性（p<0.05），7002而对3-DG还原酶活性无调节作用。
结论：以底物3-DG的消耗可以反映3-DG还原酶的活性。3-DG还原酶体外酶促反应体系最适宜条件为：100μL1mg·mL-13-DG溶液，100μL的2.5mg·mL-1NADPH，100μL的鸡肝初步纯化酶液混合，用50mmol·L-1PBS（pH7.4）缓冲溶液调反应体系至1mL，混合物于37℃培养90min。3-DG还原酶活性容易受到温度、pH变化的影响，反应体系温度在33-37℃范围内，pH在7.4-7.9时较为稳定。所提取的3-DG还原酶能表达3-DG氧化酶活性，对检测基本没有干扰。在-20℃条件下保存的3-DG还原酶酶液活性较高，随着保存时间的增加，3-DG还原酶活性降低。优化后的3-DG还原酶体外酶促反应体系，具有灵敏、稳定、可靠的特征，有望成为筛选药物的一种新方法。
四、3-脱氧葡萄糖醛酮还原酶体外酶促反应体系（在防治糖尿病微血管并发症中）的初步应用
目的：应用建立的3-DG还原酶体外酶促反应体系对已知临床防治糖尿病并发症常用药物进行实验研究，并进行相关机理探讨。
方法：将不同浓度的葡萄糖溶液（5.5、12.5、25、50、100mmol·L-1）、ARI代表药依帕司他、羰基化合物清除剂代表药氨基胍、中药成分槲皮素分别加入到3-DG还原酶体外酶促反应体系中，37℃孵育90min。用RP-HPLC法或UV法测定3-DG还原酶体外酶促反应体系中的3-DG剩余量，以单位时间3-DG的消耗量来评价3-DG还原酶活性。
结果：与不加药液的反应组相比，50和100mmol·L-1葡萄糖溶液使3-DG还原酶活性下降，具有显著性差异（p<0.05），5.5、12.5、25mmol·L-1葡萄糖对3-DG还原酶活性无增高作用（p>0.05）；ARI依帕司他对3-DG还原酶活性有完全抑制作用，与不加药液的反应组相比有显著性差异（p<0.001）；氨基胍能增加3-DG还原酶体外酶促反应体系中的3-DG的消耗量，与不加药液的反应组相比有显著性差异（p<0.001）。中药成分槲皮素对3-DG还原酶活性有一定的抑制作用，与不加药液反应组相比有显著性差异（p<0.001）。
结论：高糖对3-DG还原酶活性无促进作用，在体外葡萄糖浓度达到50、100mmol·L-1时，可使3-DG还原酶活性下降。ARI依帕司他对3-DG还原酶活性完全抑制，提示依帕司他可能会引起机体3-DG代谢受阻，3-DG水平增高，而影响ARI防治糖尿病并发症的临床疗效。氨基胍能化学结合3-DG，对3-DG还原酶活性无调节作用；中药成分槲皮素对3-DG还原酶活性有一定的抑制作用。实验模型筛选出的（部分）药物与临床防治糖尿病并发症的经验一致，提示其除了本身已知的作用靶点外，还存在如对3-DG还原酶活性起调节作用的其他靶点。

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钱泊清脑： 选D.不明白请追问.