分子实验查漏补缺系列：SDS碱裂解法制备质粒DNA
该实验方案的目的是从少量（1~2mL）细菌培养物中分离质粒DNA。DNA产量为100ng~5μg,这取决于质粒的拷贝数。少量的DNA作为体外酶促反应的底物或者模板是足够的，但是，如果质粒DNA用于测序则需要进一步纯化。
碱裂解液I：50mM Glucose，25mM Tris-HCl pH 8.0，10mM EDTA pH 8.0，灭菌后4℃保存，使用时置于冰上；
碱裂解液II：200mM NaOH，1% SDS（w/v），现用现配，于室温下使用；
碱裂解液III：3M Potassium
acetate，11.5% Glacial acetic acid，4℃保存, 使用时置于冰上;
精氨酸缓冲液：0.1mM，pH 12.4，可用pH 12.4的5M NaOH调pH；
乙醇：70%，90%；
酚：氯仿：异戊醇：25:24:1（V/V）；
STE：10mM Tris-HCl pH 8.0，100mM NaCl，1mM EDTA pH 8.0，灭菌后4℃保存，使用时置于冰上；
Tris-EDTA（TE）pH8.0：100mM Tris-HCl pH 8.0，10mM EDTA pH 8.0，使用时加入RNase A使终浓度20μg/mL。
细菌摇床，KimWipes纸巾，
a) 挑转化后的单克隆菌落，接种到2mL含有适当抗生素的培养基中，于37℃剧烈振荡过夜。此步骤需要注意的是要确保培养物通气良好，因此培养基体积不能超过试管的1/4，并且试管盖不能盖紧。另外细菌培养不要超过16小时，否则细菌会崩溃，引起细菌大量死亡，导致质粒丢失。
b) 将1.5mL培养物倒入微量离心管，剩余培养物可以储存在4℃，用微量离心机在4℃以最大转速（≥12000g）离心30s，离心完成后，尽快吸去上清，这个过程要避免接触细菌沉淀。并且尽最大可能吸干培养液，例如管壁上残余的液滴也可以用短暂离心后用吸头吸去。如果未除尽培养液可能导致质粒不能被限制性酶切或不能完全切割，这是因为细胞壁成分能抑制多种限制酶的活性。尤其是在做质粒中抽或者大抽时这个问题很有可能出现，这个时候可通过用预冷的STE（离心用菌液体积的0.25倍）重悬细菌沉淀并离心来解决。
c) 用100μL预冷的碱裂解液I重悬细菌沉淀，可以将两个微量离心管的管底互相接触同时涡旋振荡，这样可以提高细菌沉淀重悬的速度和效率，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。碱裂解液I中的葡萄糖作用是使悬浮后的大肠杆菌不会再次快速沉积到管子的底部。而EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，用来螯合大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子以及抑制DNase'的活性。
d) 加入200μL新鲜配制的碱裂解液II于每管细菌悬液中，盖紧管口，轻柔颠倒离心管5次，确保离心管的整个内壁均与碱裂解液II接触，以混合内容物，这个过程切勿振荡！之后将离心管放置在冰上。此步骤所用的碱裂解液II必须是新鲜配制，避免NaOH吸收空气中的CO2减弱了碱性，这也是很多商品化试剂盒的Solution II要求使用后尽快盖上盖子的原因。NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer (双层膜)结构向 micelle (微囊)结构的相变化所导致。另外碱裂解这个过程时间不能过长，因为在碱性条件下基因组DNA会慢慢断裂，以及剧烈震荡也会导致基因组DNA的断裂，这都会对之后的实验带来麻烦。除了断裂的基因组DNA之外，长时间暴露在碱性环境中超螺旋DNA还会出现不可逆的变性，产生环状卷曲DNA，这类DNA不能被限制酶切割。
e) 加入150μL用冰预冷的碱裂解液III，盖紧管口，反复数次颠倒，使溶液III在黏稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3~5min。碱裂解液III加入后就会有大量的沉淀，这是先由d）步骤中加入的SDS与蛋白质结合，再由e）步骤中的钾离子置换SDS（Sodium dodecyl sulfate）中的钠离子变成了十二烷基硫酸钾(Potassium dodecyl sulfate，PDS)，而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。另外基因组DNA由于本身很长也一起被PDS共沉淀了，但是如果基因组变成了50-100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了，所以碱裂解液III中的醋酸是为了中和NaOH，避免长时间的碱性条件打断DNA。这堆沉淀除了基因组DNA和蛋白质，还有大分子量RNA、细胞壁复合物等。
f) 用离心机于4℃以最大转速（≥12000g）离心5min，将上清转移至另一离心管中。这个步骤可能有无法形成紧密沉淀，这个一般是加入碱裂解液II时没有充分混匀造成，可以用20000g再次离心15min。
g) 加等量体积的酚：氯仿：异戊醇，振荡混合有机相和水相，然后用离心机于4℃以最大转速（≥12000g）离心2min。将上清转移至另一离心管中，在吸取上清的时候注意不要吸到中间层，宁可少吸取一些。此步骤在很多商品化试剂盒中被省略了，但是在需要高质量质粒的实验中或者做中抽和大抽后建议加上这个步骤，一是虽然SDS能带走大量的蛋白质，但是并没有完全去除，这些残余的蛋白质会影响之后的酶切或者其他实验，二是这些蛋白中可能混有DNase，因此想要或者稳定高质量的质粒这个步骤不能缺少。酚能最大程度的将蛋白质去掉，但是由于酚微溶于水中，因此需要加入氯仿来去除掉水相中残留的酚。至于异戊醇其作用是为了降低表面张力，减少气泡的产生，并且异戊醇有助于分相，维持离心后上层含 DNA 水相、中间层变性蛋白相、下层有机溶剂相的稳定分层。
h) 加入2倍体积的乙醇，振荡混合，置于室温2min后用离心机于4℃以最大转速（≥12000g）离心5min，收集沉淀的核酸。对于这种微量沉淀的离心，最好养成总是用同一种方式在离心机中放置离心管的习惯。例如，按顺序放置，将离心管的塑料柄朝外，这样沉淀总是在离转头中心最远的离心管内壁聚集，也就能知道DNA沉淀在什么位置便于找到可见的沉淀，也可以看不见沉淀的情况下避开沉淀吸去上清。此外在离心管的侧面和顶部做好标记，这样即使字迹模糊了也能辨识。
i) 按上述步骤吸去上清液，将离心管倒置在KimWipes纸巾上，以使所有的液体排干，或者再次短暂离心后用吸头除去原本挂在管壁上的液滴。
j) 加1mL 70%的乙醇于沉淀中并将盖紧的试管颠倒数次以让沉淀漂浮起来，用微量离心机在4℃以最大转速离心2min，吸去所有上清并再次短暂离心后用吸头除去原本挂在管壁上的液滴。
k) 打开试管的盖子置于室温挥发乙醇，5~10min，直至试管内没有可见液体存在。这个过程不可时间过长，会导致DNA脱水而难以溶解并可能变性。
l) 用50μL含有20μg/m去DNA酶的RNase A的TE（pH8.0）重新溶解核酸，温和振荡几秒，可储存于-20℃。这个步骤需要根据后续实验需要来选择最后溶解的液体，如果后续只是作为PCR，这样溶解即可；如果是用于酶切反应则最后可以用Tris-HCl来溶解；如果是用于转染以及体外转录实验则最好使用五核酸酶的水来进行溶解。
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