免疫PCR的制作方法
免疫反应过程涉及多种免疫细胞间的相互作用，如T-M，T-B Th-Ts和Ts-Tc等细胞间的相互作用，而其中Ts与Th在免疫调节中起关键作用。活化的Th细胞辅助B细胞产生抗体，辅助Tc细胞杀伤靶细胞，诱导M，表现迟发型超敏反应。而Ts细胞反过来对Th、Tc、B细胞和M的功能产生抑制作用。同样B细胞和M也可以通过多种机制对T细胞以及互相之间发挥促进和抑制的调节作用。
（一）抗原+生物素化抗体→抗原-生物素化抗体复合物；（二）加亲合素→抗原-生物素化抗体-亲合素复合物；（三）加生物素化DNA→抗原-生物素化抗体-亲合素-生物素化DNA；（四）PCR扩增生物素化DNA部分。
1 试剂
包被缓冲液：20mmol/L Tris-HCI(pH9.5），含150mmol/L NaCl和0.02%NaN3;
洗涤液：20mmol/L Tris-HCI(pH7.5），含150mmol/LNaCl0.1mmol/L EDTA和0.1%Tween20;
稀释液：20mmol/L Tris-HCI(pH7.5），含150mmol/L NaCl0.45%脱脂奶及变性鲑鱼精DNA (0.1mg/ml)
2 操作
1）包被
用包被缓冲液稀释抗原（BSA），加入微滴板中（45μl孔），4℃过夜（约15h），用洗涤液洗板3次×5min。
2）封闭：
每孔加200μl含4.5%脱脂奶及变性鲑鱼精子DNA（1mg/ml）、0.1mmol/L EDTA的20mmol/L Tris-Hcl(pH7.5）（含150mmol/L NaCl缓冲液，37℃温育80min，洗板数次。
3）抗原抗体反应：
用释释液1:8000稀释单克隆抗BSA抗体，每孔加50μl，室温（～22℃）下45min，洗板孔15次×10min，去除未结合的抗体分子。
4）链亲合一蛋白A结合反应：
每孔加入50μl用稀释液稀释的已与生物素-pUC19结合的链亲合素-蛋白A嵌合体，室温（～22℃）50min，使得嵌合体-pUC19结合于固相的抗原抗体复合物上，然后洗板15次×10min，再用无NaN3的TBS洗3次，然后即可将微滴板用于后面的PCR反应。
5）PCR
实验条件 50mmol/L KCI、10mmol/L Tris-HCI（20℃pH8.3）、1.5mmol/LMgCl2、明胶（10μg/ml）、0.8mmol/LdNTPs（每种0.2mM）、2μM引物（每一引物1μM）和TaqDNA多聚酶（50U/ml）。
PCR周期 PCR前，用紫外线（UV）（254nm）照射上述反应混合物，然后将之加入到微滴板孔中，每孔40μl，再加20μlUV照射的石蜡覆盖，按下述温度在PCR仪上进行PCR周期：起始变性94℃5min;30个周期：变性94℃5min，退火58℃1min，延伸72℃1min，最后延伸72℃ 5min，得到的PCR产物为特定的261bp的片段。 ⒈ 用0.85% NaCl将细菌溶液稀释至一定浓度。
⒉ 加50μl于微孔板内，4℃过夜。同时设阴性对照（加50μl 0.85% NaCl于另一孔内）。
⒊ 用400μl的0.05% 温20pBS（以下简称TPBS），洗涤五次。
⒋ 加入2.25%的100μl正常山羊血清（NGS) PBS封闭2小时.
⒌ 用含0.15% NGS的TPBS洗3次.
⒍ 加入100μl用0.75% NGS适当稀释的单克隆抗体（内含100μg的鲜鱼精DNA），室温孵育30min.
⒎ 用TPBS洗涤五次.
⒏ 加入50μl适量稀释的生物素化抗鼠IgG抗体，室温孵育30min.
⒐ 用TPBS洗涤五次.
⒑加入60μl适量稀释的生物素化DNA和亲和素，室温孵育30min.
⒒用TPBS洗涤五次，再用HPLC级水洗三次.
⒓PCR扩增：加入50μl PCR反应液（内含T3和T7引物），95℃ 60sec,50℃ 110sec,72℃ 110sec，循环30次.取PCR产物10μl于1.7%琼脂糖凝胶上电泳，和核酸分子量标准相比较，在相应的位置邮现电泳带为阳性.必需时将电泳结果照相，进行定量分析. 1）凝胶检测系统 用凝胶扫描仪或计算机辅助视频设备对溴化乙锭染色的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶进行定量，放射性标记的扩增产物可通过放射自显影定量测定，最近用自动DNA测序仪检测荧光标记的核酸，这种方法可准确测量扩增产物的大小，而且其检测灵敏度达fg水平，但由于自动DNA序列仪和荧光标记引物极为昂贵，所以现在仅用于研究。
2）HPLC检测系统 此法的优点为PCR产物不用纯化，对未标记的产物灵敏度可达fg水平，对标记产物的检测限度可能更低。HPLC能区分不同分子的大小，可允许我们使用不同大小的内标衡量扩增的效率。
3） 固相测定系统 最常用的为96孔聚苯乙烯微量滴定板，可用仪器比色或读数，可用亲合素分子通过疏水相互作用包被滴定板，此固相系统可特异结合生物素或生物素化的分子可用于生物素化的PCR产物的定量，如用生物素和地高辛双重标记的扩增产物可用微量滴定板法定量，将生物素和地高辛同时标记PCR产物的方法有三种途径：①在反应混合物中同时加入地高辛和生物素标记的脱氧核苷酸类似物（DIG-/Bio-dUTP）；②加入生物素化的引物1和DIG-dUTP；③加入生物素引物1和地高辛标记的引物2。定量方方法为：双重标记的扩增产物用乙醇沉淀以去除未结合的标记物，然后加至亲合素包被的微量滴定板上温育至少2小时，洗涤数次后，与DIG抗体：AP结合物温育，根据其底物不同可产生不同的颜色，亲合素介导的固相捕获生物素标记靶分子的技术是一个有效、灵活和容易操作的技术，将成为定量PCR的一个关键技术。
4）SPA(Scintillation Proximity Assay）系统 用亲合素包被的氟微球作为固相载体，用生物素标记引物，在扩增时掺入氟化的核苷酸，扩增完成后，加入已包被的氟微球以捕获生物素化的PCR产物，此捕获过程可使与氟微球紧密结合，氟被氘激发产生光脉冲，可用闪烁计数仪测量。与比色法相比，此法具有更大的线性范围。
5）点杂交检测系统 将扩增产物变性后固定于尼龙膜表面，与标记的DNA探针杂交，亦可将序列特异的寡核苷酸探针通过多聚T(poly T）尾巴固定于膜上，与变性后的已标记的扩增产物杂交，在后者由于靶基因不是直接结合于膜表面，故其反应动力学接近于液相，反应速度快，通常使用生物素化的探针或扩增产物，用亲合素-AP结合物产生颜色斑点，通过与已知浓度的标准比较颜色强度进行定量。
6） 电化学发光检测系统 通过亲合素-生物素系统将扩增产物结合于磁性珠，然后与2，2'-联吡啶-钌螯合物（TBR）标记的探针杂交，加入三丙胺（tripropylamine，TPA）溶液，并转移至电化学发光仪的检测池，当电极的电压增加至一定水平时TPA和TBR都瞬时氧化，TPA氧化后生成一种不稳定的、具有高度还原性的中间物质，可与氧化的TBR反应，使之进入激发态，当由激发态变为基态时可发射出620nm的光，发光强度与TBR标记物的量成正比，通过发光强度对PCR产物定量，此法的敏感性为amol水平，可自动化测量。
7） DNA酶免疫测定系统 通过抗DNA单克隆抗体与扩增产物结合、再通过酶第二抗体结合物进行定量测定。此法不需对引物和扩增产物进行标记，但易出现交叉反应和单克隆抗体昂贵的费用限制了此法的广泛应用。
8） 激光诱导荧光检测法 首先用荧光标记物FAM（商品名）的N-羟基琥珀酰亚胺酯衍生物借助氨已基连接臂偶联于正向引物的5'-核苷酸上，然后PCR扩增，用毛细管电泳扩增产物，最后用氩离子激光光原检测器检测荧光强度进行定量测定。此法的优点为样本用量少，可自动化检测，快速、灵敏和高分辨率。
总之，可用上述方法对靶基因定量，其准确性可通过复管测定和利用内标使数据标准化而得到提高。由于亲合素介导的固相捕获生物素标记靶分子的技术具有有效、灵活和容易操作等特点，有较好的临床应用前景。定量PCR仍然存在技术上的问题，目前多用于研究，但在肿瘤、细菌、真菌和病毒性疾病的诊断和治疗方面对此技术的需求将日益增加。
现在都有什么PCR技术?
反转录PCR,荧光定量实时PCR,巢式\/半巢式PCR,锚定PCR,单链构象多态性PCR，免疫PCR是一种抗原检测系统，将一段已知序列的DNA片段标记到抗原抗体复合物上，再用PCR方法将这段DNA扩增，然后用常规方法检测PCR产物。免疫PCR集PCR的高灵敏度与抗体和抗原反应的特异性于一体。其突出的特点是指数级的扩增效率...
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PCR技术中的缓冲液
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免疫PCR的应用和发展
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动物的检疫方法包括哪些?
动物的检疫方法包括：1、 流行病学调查；2、病理检查；3、病源检查；4、免疫学检查；5、临床检查 。知识点延伸：动物的检疫，就是按照国家法规对各种动物及其产品进行的疫病检查。通过动物检疫，对可疑或已证实的疫病对象实行强制隔离，或作出适当处理，目的是防止动物传染病的传播，保障畜牧业生产和人民...
PCR最新技术原理、方法及应用图书目录
展示了PCR技术的多样性和实用性。电子PCR和数字化PCR，以及其它创新的PCR方法在第九章中被讨论，展示了技术的不断进步和创新。在基因分型、临床诊断、流行病调查、法医学、遗传病诊断、癌症诊断以及动物学研究等领域，PCR的应用在第十一至第十六章中得到了详尽的阐述，展示了其在各个领域的重要角色。
分子诊断和基因治疗应用前景
(3)常用PCR技术:利用PCR技术,在适当条件下扩增目的基因,然后分析PCR产物,便可判断其是否为致病基因及其变异性质。PCR技术具有快速、灵敏、特异性高等特点,为扩大其应用范围,根据需要目前已衍行和发展出以下方法:①常规PCR;②复合PCR;③反转录PCR (RT-PCR);④原位PCR;⑤反向PCR;⑥膜结合PCR;⑦彩色PCR;⑧定量PCR;...
免疫诊断试剂国家工程实验室是什么单位?
―围绕国内紧缺的或技术相对落后的肿瘤、传染病、心脑血管、自身免疫、细胞因子等重大疾病相关的诊断试剂，应用免疫 PCR 技术、酶联免疫斑点检测(ELISPOT)技术等新技术研究开发了新型、新品种的免疫诊断试剂，提高了产品的技术性能指标，并研究制定规模化生产工艺和质量控制工艺，为后续的工程化与产业化开发...
大肠杆菌的检验意义和三凉食品的检验意义
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小儿丙型病毒性肝炎应该做哪些检查
(3)HCV抗原的检测：Krawczynski等从感染HCV的黑猩猩或病人血清中提取IgG组分，用异硫氰酸荧光素标记后作为探针用直接免疫荧光法检测肝组织内HCV抗原。该抗原是HCV感染的一种特异性形态标志，可作为HCV感染的实验室诊断方法之一。此外还可用免疫组化ABC法检测肝组织内HCV抗原。(4)HCV RNA的检测：HCV感染时...
樊媚精蛋：[答案] 博凌科为-为你免疫-PCR主要由两个部分组成.第一部分是类似于普通酶联免疫吸附实验(ELISA)的抗原抗体反应.第二部分即常规的PCR扩增和电泳检测.免 疫-PCR与ELISA的区别就在于ELISA是以碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶来标记抗体,用颜色...
盘山县18420202398： 免疫PCR的基本原理和大致流程是什么 - ？
樊媚精蛋： 博凌科为-为你解答:免疫-PCR主要由两个部分组成.第一部分是类似于普通酶联免疫吸附实验(ELISA)的抗原抗体反应.第二部分即常规的PCR扩增和电泳检测.免疫-PCR与ELISA的区别就...
盘山县18420202398： 各位高手谁能给我详细的讲解一下PCR技术的过程 - ？
樊媚精蛋：[答案] 聚合酶链式反应(英文全称:Polymerase Chain Reaction),聚合酶链式反应 简称PCR.聚合酶链式反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的...
盘山县18420202398： ELISA和PCR的原理和用途？
樊媚精蛋： enzyme linked immunosorbent assay,ELISA.指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上,进行免疫反应的定性和定量方法.这一方法的基本原理是:①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性.②使抗原或抗体与...
盘山县18420202398： 做pcr和wb的细胞要求无菌吗 - ？
樊媚精蛋： 做pcr和wb的细胞要求无菌 胞水平进行WB和RT-PCR所需多少细胞,一般用多大的板子培... : whole blood 全血(即未经任何方式分部分离的血液) Western Blot,“Western免疫印迹法”.是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测.对已知表...
盘山县18420202398： 怎样扩增蛋白质 - ？
樊媚精蛋： 有几种方法:1. 是已知蛋白的话可以去NCBI查DNA 序列,构建质粒,在细菌或真核细胞中表达,过柱纯化. 2. 未知蛋白需要先打质谱,确定氨基酸序列,再推测DNA序列,构建质粒,在细菌或真核细胞中表达,过柱纯化. 3. 制作此蛋白抗体,选择适当的细胞(细胞中有此蛋白且抗体在此细胞中比较特异),用制作好的抗体和选定的细胞做免疫共沉淀.(细胞的量可以弄得多一点)----不推荐,此方法费时费力且不一定特异
盘山县18420202398： PCR技术的介绍 - ？
樊媚精蛋： DNA扩增过程分为以下几个基本过程,不同的过程所需要的温度是不一样的 高温变性 90-95° 使DNA解旋 退火冷却55-60° 使解旋的单链分别与引物结合 延伸 加热70-75° 从引物开始进行互补 循环 重复上述过程大量扩增目的基因
盘山县18420202398： 最近要用PCR检测好几万个样品(玉米叶片或种子),请问有没有方法可以不用提DNA就可以直接做出PCR的?？
樊媚精蛋： maybe可以,现在叶片pcr也挺多.水稻可以,玉米也还好吧~~~ 你试一下呗~~~ 用拟南芥叶片直接作PCR得方法,共享如下: 取叶片(4平方毫米左右)置于PCR管,加0.25mol/L NaOH 40ul,沸水浴30sec,取出离心管,再加40ul 0.25mol/L ...
盘山县18420202398： 医学常识中免疫PCR主要有几种? ？
樊媚精蛋： 主要用于检测肿瘤标志物,细胞因子及病原体等微量抗原.免疫PCR目前分为四种:原位免疫PCR是一种原位检测组织或细胞中抗原的技术.细胞免疫PCR通常用于检测细胞表面膜抗原.多分析物免疫PCR利用大小不同的DNA分子标记不同的抗体,可同时检测多种抗原.单引物免疫PCR用单引物进行免疫PCR扩增,可提高PCR扩增效率.
盘山县18420202398： PCR和免疫组化可以一起做?:PCR和免疫组化可以一起做吗 ？
樊媚精蛋： 你可以取其大脑先做石蜡包埋,先做免疫组化,如果有阳性区域,可以采用显微切割技术获得你所需要的阳性和阴性细胞,经过脱蜡等步骤处理,只要获得每种细胞数大于200个即可进行基因组或者是mRNA水平上的检测.这样不仅获得的细胞基本是你所需要的,可能阳性结果更可信些.只要RT-PCR的引物设计合理,一般比较容易的.另外,我们平常大多时采用冰冻切片,此法较易理解和接受,但是假阳性结果可能发生.
