流式课堂 | 流式中的抗体滴定

~ 流式细胞术（flow cytometry）是一种生物技术，它通过流式细胞仪检测标记的荧光信号，对单细胞悬液中的细胞、血小板、细胞器等生物粒子实现高速、逐一的细胞定量分析和分选。这一技术在临床医学和基础医学中应用广泛，尤其在血液病研究和机体免疫功能研究方面占有重要地位。

为什么要进行抗体滴定？由于实验所用细胞和条件不同，经常会出现抗原阴性细胞非特异染色等问题。抗体滴定法通过计算、比较染色指数，可以找到使抗原阳性细胞群和阴性细胞群达到最佳分离效果的实验条件。细胞数量、染色时间和固定与否等因素也会对染色效果产生影响。因此，抗体滴定是确定最佳抗体浓度和数量、消除非特异染色、实现信噪比最高的方法。

为何不直接使用厂家推荐的抗体浓度？虽然厂家推荐的浓度可以满足实验需求，但往往过高，导致抗体浪费和实验成本增加。此外，使用过量抗体还会提高样本的自发荧光。而不同实验的细胞、方案和实验室温度等条件都不尽相同，进行抗体滴定实验可以更好地达到实验效果并节省抗体。

信噪比（Signal to Noise Ratio，SN）是描述信号中有效成分与噪声成分比例关系的参数。计算信噪比可以得出最佳分离浓度，信噪比值越大，分离效果越好。

染色指数（staining index，SI）是衡量阳性细胞群和阴性细胞群之间分离程度的指标，它与荧光素阳性群的平均荧光强度（mean fluorescent intensity，MFI）成正比，与荧光素阴性群的 MFI 成反比。

细胞数量、抗体孵育时间、固定步骤等因素都会对抗体染色产生影响。通过实验设计可以分析这些因素对抗体染色指数的影响，从而探究影响细胞抗体染色的关键因素。

实验案例：以小鼠骨髓细胞为被标记细胞，使用非串联荧光染料FITC标记的大鼠抗小鼠CD11b抗体进行标记。通过计算不同浓度抗体标记小鼠骨髓细胞的染色指数进行抗体滴定，确定合适的抗体浓度区间。

抗体滴定注意事项：在进行抗体滴定实验时，需要注意实验条件的一致性，确保实验结果的准确性。

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湘桥区18398757552： 流式分析一定要用专门的直标抗体吗 - ？
尔怖依托： 不一定能通用.你师姐用来做流式,是用直接标记,还是间接标记?如果是直接标记的话,那这个抗体一般不是FITC标记或者就是TRITC,PE之类的.如果恰好你的免疫组化,也是想用荧光素标记的抗体来直接标记,那就可以通用.如果你的免疫组化要用其它的标记的话,或者是间接标记的话,就有麻烦,因为荧光素的标记很可能会影响二抗和一抗的结合.

湘桥区18398757552： 流式细胞用的抗体是单抗还是多抗 - ？
尔怖依托： 流式检测,都是要使用单抗.有几个原因:单抗的特异性好,染色后的荧光强度和抗原表达水平是线性关系,不同批次间的变化较少.多抗虽然可能可以产生更强的信号,但是特异性差,染色后荧光强度和抗原水平不是线性关系,不同批次差异很大.所以流式检测不使用多抗.

湘桥区18398757552： 流式细胞术中非特异性显色是如何产生的 - ？
尔怖依托： 流式的isotype对照(同型对照),就是使用相同标记,相同亚型的非特异性抗体,在另外一个管子的样本,采用同样的染色步骤染色.比如,你使用了小鼠IgG1,PE标记的特异性抗体,那就选用小鼠IgG1,PE标记的非特异性抗体.下面这个图,是一个比较典型的使用了同型对照的结果图灰色的曲线是未染色的样本,黄色是同型对照,红色是特异性抗体染色.由于细胞对抗体的非特异性结合,一般同型对照都会比未染色样本的荧光信号要强.所以设置阴性阈值的时候,要根据同型对照,而不是未染色的细胞.

湘桥区18398757552： 如何看流式细胞图 - ？
尔怖依托： 流式的图一般是两种形式.一是柱状图,X轴是信号强度,Y轴是计数.数据通常显示为峰值.比如阴性或者信号弱的峰在左侧,而阳性或者信号强的就位于右侧.柱状图一次只能显示一个通道信号,通常用来判断阳性,阴性的区别或者单个通道信号在不同样本间的变化. 另外一种形式是散点图.就是把两个通道的信号同时显示在图上.优点是由于同时显示两个通道的信号,可以提供比柱状图更多的信息.多色流式样本检测一般都是通过上下级关系的图来显示不同的图.比如在上一级的图中先针对某个细胞群画了个门,然后该门内所有细胞又可以用其他通道的信号显示到另外一个图上进行进一步的分析.

湘桥区18398757552： 细胞内细胞因子的流式细胞怎样检测?？
尔怖依托：胞内流式分析法是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合,即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌,同时采用特殊的化学与抗体选择,确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景.具有其它方法难以比拟的优点: 快速:流...

湘桥区18398757552： 流式抗体如何选择? - ？
尔怖依托： 第一看清楚抗的是你的目标蛋白质没错,目标蛋白的物种不要搞错了,有些抗体对好几个物种的目标蛋白有反应,对你的实验有没有影响.第二抗体的物种是小鼠,大鼠,兔子还是什么.虽然现在荧光都标记好了,一般不需要二抗.但最好还是...

湘桥区18398757552： 流式看m1/m2比例选什么抗体 - ？
尔怖依托： 有这么几个原则:尽量使用已经用荧光素标记好的单克隆抗体.如果是单色实验,荧光素的亮度越强越好,比如标记了APC的抗体就要比标记了pacific blue的在相同抗原量,抗体用量相同的情况下,要亮很多 如果是多色实验,除了不要使用光谱重叠度高的荧光素以外,还要搭配染色指数.简单的说,就是用亮度强的荧光素标记的抗体来染水平低的抗原,而用较弱的荧光素标记的抗体来染高表达的抗原.

湘桥区18398757552： 流式与westen在检测蛋白表达方面各有什么优缺点?？
尔怖依托： 流式细胞仪当然可以检测细胞内蛋白,这一点,并不是很难,当然要比检测细胞表面抗原复杂些,好在都已经有现成的方法,不成问题. 不过流式的应用原理主要还是抗原和抗体反应和western、免疫组化没有本质差别,但是由于免疫组化和...

湘桥区18398757552： 在制作流式细胞仪的样本时怎么调整样本的细胞浓度在1 - ？
尔怖依托： 流式细胞仪样本浓度其实是要有两步都要计数,测细胞浓度的.第一步是抗体染色的时候.每种抗体都要事先使用不同工作浓度,计算出最佳染色指数.以后实验,都要遵照这个工作浓度(固定的细胞浓度,固定的抗体浓度).第二部是染色后,因为染色会导致细胞损失.所以要重新计数.同一个实验的所有样本都要保持相同的细胞浓度,这样样本通过机器的流速才相同.样本的分辨率也就一致了.细胞浓度,就是先计数单位体积内的细胞数,然后根据所得值稀释到所要的浓度.

湘桥区18398757552： 流式实验中二抗荧光标记具体显何种颜色? - ？
尔怖依托： 流式里二抗的颜色一般就红绿两种,要根据你机器的激发光波长来决定用哪种二抗了