如何进行DNA甲基化分析

如何进行DNA甲基化分析~

DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。
1、甲基化特异性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）
用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。
2、亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）
用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。
3、高分辨率熔解曲线法（High Resolution Melting，HRM）
在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化（图1）。
其中，样品要求：细胞（≥106 个）、组织（≥300mg）、血液（≥1ml）、血清（≥1.5ml）等样品材料，基因组DNA（体积≥20μl，浓度≥50 ng/μl）。

如何分析promoter的甲基化
DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一，真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下的CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因重新活化和表达。这种DNA修饰方式在不改变基因序列的前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA甲基化状态与生长发育调控及生理状态密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则程高度的甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。
原核生物中甲基化多发生在CCA/TGG和GATC序列；真核生物中DNA甲基化一般发生在CpG位点上；哺乳动物DNA甲基化只发生在CpG岛的胞嘧啶，植物甲基化发生在CpG和CpNpG。甲基化会使胞嘧啶转为5-甲基胞嘧啶，CpG位点在基因组是不常见的，主要密集于接近基因启动子的位置，统称为CpG岛。CpG位点的甲基化可以对基因表现有重要的影响。
哺乳动物中，CpG序列在基因组中出现的频率仅有1%，远低于的其它双核苷酸序列。但在基因组的某些区域中CpG序列密度很高，可以达均值的5倍以上即所谓的CpG岛。通常，CpG岛大约含有500多个碱基，位于基因的启动子区或第一个外显子区。 在哺乳动物基因组中约有4万个CpG岛，而且只有CpG岛的胞嘧啶能够被甲基化。

基因甲基化的检测方法主要有以下几种：
甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP)

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。

2、亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。
3、甲基化敏感扩增多态性
(Methylation-Sensitive Amplified Polymorphism,MSAP)
MSAP是利用对DNA甲基化敏感的两种同裂酶Hpa II和Msp I来对基因组DNA进行酶切和连接。由于两种酶能够识别相同的限制性酶切位点，即CCGG位点。当DNA序列中的CCGG位点出现不同程度的甲基化状态时，会分别被这两种酶识别，以有无产物的方式体现出来。

4、焦磷酸测序(Pyrosequencing)
通过准确定量单个连续的CpG 位点上的甲基化频率，焦磷酸测序能检测并定量甲基化水平上的细微改变。在序列延伸过程中，根据C和T的掺入量来定量确定单个位点的C-T比例。因此，不同位点的甲基化变异就能被准确检测。由于焦磷酸测序提供了真实的序列数据，甲基化状态也就以序列形式呈现。

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科尔沁区15787276420： 如何进行DNA甲基化分析 - ？
毅伯奥替： DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一,真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶,即在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5'-端的胞嘧啶转变为5'-甲基胞嘧啶.DNA甲基化通常抑制基因表达,去甲基化则诱导了基...

科尔沁区15787276420： DNA甲基化的检测方法主要包括哪些? - ？
毅伯奥替：[答案] 去哪里找最出色的生命科学学术交流论坛?>>> 方法概括起来可分为三类:基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找.1) 基因组整体水平甲基化分析a) 高效液相色谱柱(HPLC)及相关方法...

科尔沁区15787276420： DNA甲基化的检测方法主要包括哪些? - ？
毅伯奥替： 参考见解:方法概括起来可分为三类:基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找.1) 基因组整体水平甲基化分析 a) 高效液相色谱柱(HPLC)及相关方法 b) SssI 甲基转移酶法 c) 免疫化学法 d) 氯乙醛法2) 特异性位点的DNA甲基化的检测 a) 甲基化敏感性限制性内切酶(MS-RE)-PCR/Southern法 b) 直接测序法

科尔沁区15787276420： DNA甲基化检测有哪些方法?? - ？
毅伯奥替： DNA甲基化检测: Southern Blot杂交、 Bisulfite Sequencing and McrBC-PCR

科尔沁区15787276420： 如何检测甲基化的程度? - ？
毅伯奥替： 先用中亚硫酸盐处理,使DNA中未发生甲基化得胞嘧啶脱氨基转化为尿嘧啶而甲基化的胞嘧啶保持不变,PCR扩增得到所需片段,片段中尿嘧啶全部转化成T,然后对PCR产物测序,并与未处理的序列比较,判断CpG位点是否发生甲基化.我们研究院对甲基化检测很专业,感兴趣的话,可以看看:中关村华康基因研究院

科尔沁区15787276420： dna甲基化测序的数据怎么分析 - ？
毅伯奥替： bsp测序是dna甲基化检测的金标准.我想如果bsp能得到阳性结果,就没有必要再做msp了或其他了. 如果非得做msp,而且有连续的cpg区域,应该能看得出区别的,虽然u,m很可能都有条带.要得出漂亮结果,可能还得反复摸索条件.

科尔沁区15787276420： 如何分析promoter的甲基化 - ？
毅伯奥替： 如何分析promoter的甲基化 DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一,真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶,即在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下的CpG二核苷酸5'端的胞嘧啶转变为5'-甲基胞嘧啶.大量研究表明,DNA甲基化能引起染...

科尔沁区15787276420： 甲基化的甲基化检测技术 - ？
毅伯奥替： 曾经是2009年最值得关注的技术.遗传上除了ATGC这四种碱基,人们对第五种碱基-甲基化的胞嘧啶的兴趣也日益增加.甲基化修饰的存在对DNA转录的调控起了重要作用,异常的甲基化往往是许多疾病的起因.既然如此重要,系统绘制甲基...

科尔沁区15787276420： 如何查找印记基因的差异甲基化区域 - ？
毅伯奥替： 找甲基化位点也就CpG岛一般是有以下几个方法:1. MSP,亚硫酸氢盐转化后,将你想测的基因区域(如启动子区)转入细菌质粒中,进行测序(金标准).挑克隆7/10是甲基化的克隆认为这个位点70%甲基化.大概可以测400+片段,但是问题是...

科尔沁区15787276420： DNA甲基化的最主流研究方法是什么 - ？
毅伯奥替： 甲基化特异性PCR(MSP),或甲基化组测序.适用对象不一样,前者针对特定基因的甲基化水平,后者针对全基因.