westernblot内参GAPDH成功了
说起昨天,真的很心酸。虽然以前看过同门大致做了一遍,但许多细节还是不清楚的。自己亲身体验才清楚。。。
1.蛋白测定之后要加5X SDS上样缓冲液,该怎么加呢?是所有的标本一起加了,还是就算准备上样的量?经中心试验室CWW指点后才知道,可以一起加了。就是把蛋白样品的体积除以4就是了,这样的5Xbuffer就变为了1X。
2.紧接着是配胶,也是一堆问题。过硫酸铵(AP),给我的是一支0.5g干粉,说明书说配成10%溶液,我先是拿1mlDDW稀释,然后去了100ul在稀释成1ml。结果依据产品说明书的要求配置分离胶,过了一个消失还是不能凝固。多方求教之后才发现AP,只有5%(Oh,my god!)。于是再取了100ul加入AP溶液中,这下就解决问题。 在配胶过程中,分离胶和浓缩胶所使用的SDS浓度是不一样的。一个1cm的胶,可能需要5ml的制胶液体。
3.配胶归配胶,分离胶的玻璃板如何安装才能不漏液也是一门技术活。我没有提前去把玻璃板清洁,只是临时把玻璃板清洗、擦干、再吹干。(这浪费了许多时间,故建议有自己专属的玻璃板,后者提前准备好。)在安装玻璃板的时候,要准备剥离板的底端要齐整,然后扣在制胶架上,要将绿色的卡夹下压到底,这样才能密切贴合。不然就像我那样,胶(前面提高胶不会凝固)就从缝隙里流光了。有人建议可以在剥离板上涂一些凡士林,有减少漏液的功效。
4.好不容易把胶制好了,开始跑电泳。电泳内槽也开始漏液,真是急死人了。(这时候,老病号的电话打过来了,之前和他约好11点的时候见面,安排复查事宜。两个事情堆在一起急死了。)肾内科的老师LLL建议我把电泳槽灌满电泳液,就没办法漏了,一开始想是个好办法,后来想想把胶重装一遍吧。在重装的过程中确实发现了问题所在,原来内槽上面有一个类似台阶的小疙瘩,之前没有注意到,没有将它配齐,故而留有缝隙,漏液了。于是针对性地重装了一遍,内槽不漏液了。开始电泳。电泳显示选择60V跑浓缩胶,跑了大概十分钟,发现没有啥动静,也没有传说中的泡泡冒出。认真核实了一下电路,没有接错之后,就赶紧去处理老病号的事情。临走之前还让麻醉的小兄弟JZT帮我瞄一眼。这位小兄弟一本正经地和我说,短路了。这可把我吓了一跳,赶紧电话追过去。原来他所谓的短路,是电泳内槽水漏没了。我十分悲伤地放下了电话,抱怨今天白忙活了。等我回到实验室,打开盖子,惊喜地发现电泳内槽水是满的。也发现了marker条带出来了。就是时间很久。大概过了一个消失,终于把分离胶跑完了。开始跑分离胶,设置100V,又过了一个小时,分离胶才跑了三分之一,于是把电压调到120V,又过了一个小时,分离胶才跑了三分之二。眼瞅着下午五点了,而且内参的条带已经出来了,索性把电压调到了150V,没到半小时,就跑完了。
5.转膜。电泳的过程相对比较顺利。不过切胶也切了我大半天,犹豫怎么下手就花了10分钟,现在想来,就是目标条带的判断准确之后,先切去浓缩胶和不要的孔道,然后切去剩下的分离胶。剪PVDF膜和活化膜,比较顺利。在“三明治”的配置过程中,耽搁了一会儿。一定要切记胶和膜的对应方向,膜上还要做个标记,以便判断蛋白所在的位置。开始电转的时候,已经快七点了,一看protocol要60V电转2小时,当时就有些想放弃了。好在问了一位高手YRL,她建议300mA电转45分钟就可以了。我一听一下子轻松了不少。
6.封闭。5%牛奶封闭了一会儿,直接扔冰箱里了。因为已经体力不支了,所以电脑也没带回去。在这期间我把病理切片的名单写在了载玻片上面,算是弥补了一点原本当天要完成的工作。
今天,早早地过去,就是希望把westernblot的流程完成了。
1.洗膜。1X TBST洗膜,这个我已经提前配置好了,没有压力。5minX3次。
2.孵一抗。按照GAPDH说明书,1:4000稀释一抗。我还以为4ml的一抗稀释液要16ul的抗体。我一想,有点不合理吧。我买的GAPDH总共才25ul,一次性全部用了。好在问了肾内科的LLL,跟我解释了一下。原来是抗体和一抗稀释液的配比是1ul和4000ul,果然这样才合理。就这样开开心心地常温孵化抗体3h。在这期间去了趟病理科,把昨天弄好的病理组织块切回来,准备下一步免疫组化。
3.去完病理科,吃了个午饭,没有休息继续奋斗。到细胞房惊喜地发现放在别人细胞层的140细胞居然一点污点都没有。这是细胞培养箱的问题吗?还是我一直怀疑的培养基问题,抑或是培养液没有提前预热的问题?总之,细胞状态很好,就准备一传三,同时冻存一部分。而这次510又开始一反常态,污点变多了,但没有之前增殖那么快,所以今天510我全部扔了。同时将第一次的510复苏了。希望你要好好的,明天见分晓。
4.回收一抗。(请注意,如果你要回收抗体,建议将抗体在冰上孵育,以保证抗体质量)。TBST洗膜三遍,5minX3次。
5.孵二抗。就简单多了。按说明书1:5000稀释,于是乎,二抗和二抗稀释液的配比是1ul和5000ul,继续常温孵化了2h。回收二抗。TBST洗膜三遍,5minX3次。
4.ECL曝光。今天很幸运,在曝光的时候碰到之前认识的一个小兄弟HMT,还认真地教我一遍,包括具体的方法及其选择事由。这次曝光发现了内参还是比较整齐,其上混有一些杂带。继续找人帮我解决。
于是乎,到今天下午,我总算把WB的流程磕磕碰碰地做了一遍,算是小有结果吧。明天看一下M3的曝光情况。期待明天SZM同学给我带来新的食管细胞109和709。还有继续筹备免疫组化的东西,落实het-1a细胞的状况。。。
附: Elivision二步法免疫组化染色步骤
1 石蜡印片脱蜡和水化后,用PBS(pH7.4)冲洗二次,每次3分钟(3x3min)
2 根据每种抗体的要求,对组织抗原进行相应的修复。
3 如果有必要,每张切片加1滴或50ul的3%H202,室温孵育10分钟,以阻断内原性 过氧化物酶的活性。PBS冲洗3x3·.
4 除去PBS液,每张印片加1滴或50ul第一抗体(用户自选),室温孵育60分钟或4'C 过夜,建议参见每种抗体的说明书。
5 PBS冲洗3x5’。除去PB5液,每张印片加1滴或50ul聚合物增强刑(试剂 A ),室腽孵育20分钟.PBS冲洗3x3.
6 除去PBS液,每张切片加1滴或50ul酶标抗鼠/免聚什物(试剂 B ),室温孵育30分钟。PBS冲洗3x3·.
7 除上PBS液,每张切片加1滴或5Oul新鲜配制的DAB或AEC溶液,显微镜观察3~5分钟( DAB )或10分钟( AEC )。
8 自来水冲洗,苏木素复染,若有必要,可用0.1%HCl分化自来水冲洗,PBS返蓝.
9 如果用DAB显色,则切片经梯度酒精脱水干燥,(二甲苯透明),中性树胶封片,如果用AEC显色,则切片不能酒精脱水, 而直接用水性封片剂。
eastern blot
eastern blot:电驱动转移等电聚焦电泳后的蛋白区带 biotting历史如下(来自电泳的原理应用及进展):转印电泳最先是由Southern于1975年发明的。在电流作用下,他成功地将DNA片段从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维膜上进行分子杂交分析,因此称为Southern-blotting。后来,Alwine用类似方法也成功地将RNA从电泳胶中转...
Western杂交这个名字中的western是怎么来的?
先是一个叫Southern的人发明Southern blot 后来发明的类似的RNA杂交就和Southern对应地取了个名字叫Northern blot 再后来的蛋白杂交就过来凑数干脆叫Western blot 也许以后谁在发明个类似的杂交技术就会叫Eastern blot了,那东南西北都全了。
什么是“万圣节”
挪威基督徒的圣灵节 挪威圣灵节(Elven Blot) 在古老传说(挪威宗教)以及如今的恢复传统研究(Ásatru)中提到,万圣 化装舞会夜当天曾是一个祭献的节日blot,宰杀牲口祭献精灵,供奉食物祈神赐福。 一首1020年左右的诗作,Sigvatr Þorðarson的Austrfaravisur(“东方旅行诗(Eastern-journey verses)”)有此记录。作...
蛋白质印迹为什么叫western blot
的印迹分析称为Western印迹法,对双向电泳后蛋白质分子的 印迹分析称为Eastern印迹法。其实主要是,首先用类似方法的人叫个Southern,后面的就用剩下的 方向命名了。还有什么问题可以再问我。
三种印迹技术的原理及区别
三种印迹技术的原理及区别:印记技术是指将在凝胶中别离的生物大分子转移或直接放在固定化介质上并加以检测分析的技术。它主要包括 DNA 印迹技术 (Southern blot) 、 RNA 印迹技术 (Northern blot) 和蛋白质印迹技术 (Western blot) 等。原理:当模板分子(印迹分子)与聚合物单体接触时会形成多重作用点...
什么是万圣节
挪威圣灵节(Elven Blot) 在古老传说(挪威宗教)以及如今的恢复传统研究(Ásatru)中提到,万圣夜当天曾是一个祭献的节日blot,宰杀牲口祭献精灵,供奉食物祈神赐福。 一首1020年左右的诗作,Sigvatr Þorðarson的Austrfaravisur(“东方旅行诗(Eastern-journey verses)”)有此记录。作者作为一个基督徒,曾拒绝在瑞典...
万对节的来历
万圣节的来历 两千多年前,欧洲的天主教会把11月1日定为“天下圣徒之日” (ALL HALLOWS DAY) 。“HALLOW” 即圣徒之意。传说自公元前五百年,居住在爱尔兰、苏格兰等地的凯尔特人(CELTS) 把这节日往前移了一天,即10月31日。他们认为该日是夏天正式结束的日子,也就是新年伊始,严酷的冬季开始的...
蓝舌石龙子分类
蓝舌石龙子的种类繁多,主要可以分为以下几类:首先,东部蓝舌石龙子(T. scincoides scincoides),是最常见的一种,背部有7-8条斜纹,眼睛后方常见黑色条纹,前腿无花纹,体型普遍,分布于澳洲东部和东南部。其中,巨人东部蓝舌(King Eastern)亚种甚至可达到50-60厘米的体长。西部蓝舌石龙子(T. ...
急求山东英语导游词
Mountain, a green spring, summer shade Blot out the Sun, golden autumn flowering, winter is everywhere Yushu Qionghua. Laoshan mountain and its wonders,'s profound quiet forever, "the immortals cave house," and "caves" reputation redoubled emperors and generals, scholars Ascot, who's respected...
万圣节是怎么来的
万圣节又叫诸圣节,在每年的11月1日,是西方的传统节日。节日起源:两千多年前,欧洲的基督教会把11月1日定为“天下圣徒之日” (ALL HALLOWSDAY) 。“HALLOW” 即圣徒之意。传说自公元前五百年,居住在爱尔兰、苏格兰等地的凯尔特人(CELTS) 把这节日往前移了一天,即10月31日。他们认为该日是夏天...
磨疮肝毒: 常用的蛋白内参有 beta actin 和 GAPDH,它们是有区别的 GAPDH分子量为146KD,检测条带大约在36kD,beta actin分子量为42KD.一般选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上另外,细胞总蛋白的Western Blot的内参蛋白一般用 beta actin ,膜蛋白的Western Blot一般用GAPDH为内参
曲阳县17153362583: GADPH是什么 - ?
磨疮肝毒: GAPDH是参与糖酵解的一种关键酶,由4个30-40kDa的亚基组成,分子量146kDa,检测条带大约在36kDa.GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达,广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参.因为GAPDH 作为管家基因在同种细胞或者...
曲阳县17153362583: Western Blot为什么必须要用内参 - ?
磨疮肝毒: 内参作为一个参考物选用一个表达量相对稳定的蛋白,如actin,GAPDH等.不同方法处理细胞时内参的表达量不变,目的蛋白有可能会有变化.western中各泳道的内参的条带一样,那说明蛋白浓度一样.总蛋白浓度一样,目的蛋白条带宽度差异才能体现出目的蛋白表达量的差别.
曲阳县17153362583: 什么时候选择线粒体内参抗体? ?
磨疮肝毒: 我们知道,在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参蛋白,这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达,由于内参在各组...
曲阳县17153362583: western blot 的一抗是内参抗体吗 - ?
磨疮肝毒: 内参抗体是个什么鬼? 一抗就是你要检测的目的抗体. GAPDH作为内参的话,也是要孵它的一抗
曲阳县17153362583: Western blot 内参跑不齐怎么调整 - ?
磨疮肝毒: 第一,应该确认每个样品表达GAPDH的量一样,虽然是持家基因,本人觉得不同细菌可能表达量不一样,造成信号强弱不一样.可以通过考马斯亮蓝染色来确定上样量的差异,调整上样量一样再检测GAPDH. 第二,内参跑不齐.一般是跑胶...
曲阳县17153362583: WB试验之如何选择内参抗体 - ?
磨疮肝毒: 你选择的目的蛋白位于什么地方~细胞核 胞质 线粒体~你要观察的是目的蛋白在哪一部分的含量~选择相应的内参~全细胞比如GAPDH HSP90AA1等~还有内参分子量要与目的蛋白分子量有一定差距~避免分不开~当然你可以选择不同种属的抗体来避免这个问题~
曲阳县17153362583: 血清western blot怎样选择内参 - ?
磨疮肝毒: 网络搜索了解到:1. 由于血浆或血清中很难找到一个稳定表达的蛋白,常见的在组织中比较常用的内参蛋白如肌动蛋白,GAPDH等,严格讲并不适合血浆或血清;2. 可以考虑用立春红染色 或考染做loading control(这种方法在不少文献中都有报道,是大家认可的)3. Blood上有些文章 用的是立春红染色做control
曲阳县17153362583: western blot等生物学试验中的内参是什么意思? - ?
磨疮肝毒:[答案] western blot用来检测蛋白表达的变化,而检测表达变化的前提就是,你每个孔跑得总蛋白量是相同的,如果上样量都不同,还怎么检测不同组间目的蛋白量的区别,这样内参就可以作为检测蛋白上样量是否相同的标准.内参一般选那...
曲阳县17153362583: western blot为什么要两次免疫反应 - ?
磨疮肝毒: 第一次免疫反应是为了让一抗结合目的蛋白,也可以说是让一抗特异性的识别出目的蛋白.达到检测的目的 第二次免疫反应时为了让二抗结合一抗,二抗上面有辣根过氧化物标记,结合一抗后就可以用ECL试剂反应,达到显影的效果经过两次免疫反应后最终检测出目的蛋白