westernblot内参GAPDH成功了

~ 2019-01-09 星期三 晴

说起昨天，真的很心酸。虽然以前看过同门大致做了一遍，但许多细节还是不清楚的。自己亲身体验才清楚。。。
1.蛋白测定之后要加5X SDS上样缓冲液，该怎么加呢？是所有的标本一起加了，还是就算准备上样的量？经中心试验室CWW指点后才知道，可以一起加了。就是把蛋白样品的体积除以4就是了，这样的5Xbuffer就变为了1X。
2.紧接着是配胶，也是一堆问题。过硫酸铵（AP），给我的是一支0.5g干粉，说明书说配成10%溶液，我先是拿1mlDDW稀释，然后去了100ul在稀释成1ml。结果依据产品说明书的要求配置分离胶，过了一个消失还是不能凝固。多方求教之后才发现AP，只有5%（Oh，my god！）。于是再取了100ul加入AP溶液中，这下就解决问题。 在配胶过程中，分离胶和浓缩胶所使用的SDS浓度是不一样的。一个1cm的胶，可能需要5ml的制胶液体。
3.配胶归配胶，分离胶的玻璃板如何安装才能不漏液也是一门技术活。我没有提前去把玻璃板清洁，只是临时把玻璃板清洗、擦干、再吹干。（这浪费了许多时间，故建议有自己专属的玻璃板，后者提前准备好。）在安装玻璃板的时候，要准备剥离板的底端要齐整，然后扣在制胶架上，要将绿色的卡夹下压到底，这样才能密切贴合。不然就像我那样，胶（前面提高胶不会凝固）就从缝隙里流光了。有人建议可以在剥离板上涂一些凡士林，有减少漏液的功效。
4.好不容易把胶制好了，开始跑电泳。电泳内槽也开始漏液，真是急死人了。（这时候，老病号的电话打过来了，之前和他约好11点的时候见面，安排复查事宜。两个事情堆在一起急死了。)肾内科的老师LLL建议我把电泳槽灌满电泳液，就没办法漏了，一开始想是个好办法，后来想想把胶重装一遍吧。在重装的过程中确实发现了问题所在，原来内槽上面有一个类似台阶的小疙瘩，之前没有注意到，没有将它配齐，故而留有缝隙，漏液了。于是针对性地重装了一遍，内槽不漏液了。开始电泳。电泳显示选择60V跑浓缩胶，跑了大概十分钟，发现没有啥动静，也没有传说中的泡泡冒出。认真核实了一下电路，没有接错之后，就赶紧去处理老病号的事情。临走之前还让麻醉的小兄弟JZT帮我瞄一眼。这位小兄弟一本正经地和我说，短路了。这可把我吓了一跳，赶紧电话追过去。原来他所谓的短路，是电泳内槽水漏没了。我十分悲伤地放下了电话，抱怨今天白忙活了。等我回到实验室，打开盖子，惊喜地发现电泳内槽水是满的。也发现了marker条带出来了。就是时间很久。大概过了一个消失，终于把分离胶跑完了。开始跑分离胶，设置100V，又过了一个小时，分离胶才跑了三分之一，于是把电压调到120V，又过了一个小时，分离胶才跑了三分之二。眼瞅着下午五点了，而且内参的条带已经出来了，索性把电压调到了150V，没到半小时，就跑完了。
5.转膜。电泳的过程相对比较顺利。不过切胶也切了我大半天，犹豫怎么下手就花了10分钟，现在想来，就是目标条带的判断准确之后，先切去浓缩胶和不要的孔道，然后切去剩下的分离胶。剪PVDF膜和活化膜，比较顺利。在“三明治”的配置过程中，耽搁了一会儿。一定要切记胶和膜的对应方向，膜上还要做个标记，以便判断蛋白所在的位置。开始电转的时候，已经快七点了，一看protocol要60V电转2小时，当时就有些想放弃了。好在问了一位高手YRL，她建议300mA电转45分钟就可以了。我一听一下子轻松了不少。
6.封闭。5%牛奶封闭了一会儿，直接扔冰箱里了。因为已经体力不支了，所以电脑也没带回去。在这期间我把病理切片的名单写在了载玻片上面，算是弥补了一点原本当天要完成的工作。

今天，早早地过去，就是希望把westernblot的流程完成了。
1.洗膜。1X TBST洗膜，这个我已经提前配置好了，没有压力。5minX3次。
2.孵一抗。按照GAPDH说明书，1:4000稀释一抗。我还以为4ml的一抗稀释液要16ul的抗体。我一想，有点不合理吧。我买的GAPDH总共才25ul，一次性全部用了。好在问了肾内科的LLL，跟我解释了一下。原来是抗体和一抗稀释液的配比是1ul和4000ul，果然这样才合理。就这样开开心心地常温孵化抗体3h。在这期间去了趟病理科，把昨天弄好的病理组织块切回来，准备下一步免疫组化。
3.去完病理科，吃了个午饭，没有休息继续奋斗。到细胞房惊喜地发现放在别人细胞层的140细胞居然一点污点都没有。这是细胞培养箱的问题吗？还是我一直怀疑的培养基问题，抑或是培养液没有提前预热的问题？总之，细胞状态很好，就准备一传三，同时冻存一部分。而这次510又开始一反常态，污点变多了，但没有之前增殖那么快，所以今天510我全部扔了。同时将第一次的510复苏了。希望你要好好的，明天见分晓。
4.回收一抗。（请注意，如果你要回收抗体，建议将抗体在冰上孵育，以保证抗体质量）。TBST洗膜三遍，5minX3次。
5.孵二抗。就简单多了。按说明书1:5000稀释，于是乎，二抗和二抗稀释液的配比是1ul和5000ul，继续常温孵化了2h。回收二抗。TBST洗膜三遍，5minX3次。
4.ECL曝光。今天很幸运，在曝光的时候碰到之前认识的一个小兄弟HMT，还认真地教我一遍，包括具体的方法及其选择事由。这次曝光发现了内参还是比较整齐，其上混有一些杂带。继续找人帮我解决。

于是乎，到今天下午，我总算把WB的流程磕磕碰碰地做了一遍，算是小有结果吧。明天看一下M3的曝光情况。期待明天SZM同学给我带来新的食管细胞109和709。还有继续筹备免疫组化的东西，落实het-1a细胞的状况。。。

附： Elivision二步法免疫组化染色步骤
1 石蜡印片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗二次，每次3分钟(3x3min)
2 根据每种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。
3 如果有必要，每张切片加1滴或50ul的3％H202，室温孵育10分钟，以阻断内原性 过氧化物酶的活性。PBS冲洗3x3·．
4 除去PBS液，每张印片加1滴或50ul第一抗体(用户自选)，室温孵育60分钟或4'C 过夜，建议参见每种抗体的说明书。
5 PBS冲洗3x5’。除去PB5液，每张印片加1滴或50ul聚合物增强刑(试剂 A )，室腽孵育20分钟．PBS冲洗3x3．
6 除去PBS液，每张切片加1滴或50ul酶标抗鼠／免聚什物(试剂 B )，室温孵育30分钟。PBS冲洗3x3·．
7 除上PBS液，每张切片加1滴或5Oul新鲜配制的DAB或AEC溶液，显微镜观察3~5分钟( DAB )或10分钟( AEC )。
8 自来水冲洗，苏木素复染，若有必要，可用0.1％HCl分化自来水冲洗，PBS返蓝．
9 如果用DAB显色，则切片经梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封片，如果用AEC显色，则切片不能酒精脱水， 而直接用水性封片剂。

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曲阳县17153362583： 我想做PCR内参选beta - actin还是GAPDH好 - ？
磨疮肝毒： 常用的蛋白内参有 beta actin 和 GAPDH,它们是有区别的 GAPDH分子量为146KD,检测条带大约在36kD,beta actin分子量为42KD.一般选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上另外,细胞总蛋白的Western Blot的内参蛋白一般用 beta actin ,膜蛋白的Western Blot一般用GAPDH为内参

曲阳县17153362583： GADPH是什么 - ？
磨疮肝毒： GAPDH是参与糖酵解的一种关键酶,由4个30-40kDa的亚基组成,分子量146kDa,检测条带大约在36kDa.GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达,广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参.因为GAPDH 作为管家基因在同种细胞或者...

曲阳县17153362583： Western Blot为什么必须要用内参 - ？
磨疮肝毒： 内参作为一个参考物选用一个表达量相对稳定的蛋白,如actin,GAPDH等.不同方法处理细胞时内参的表达量不变,目的蛋白有可能会有变化.western中各泳道的内参的条带一样,那说明蛋白浓度一样.总蛋白浓度一样,目的蛋白条带宽度差异才能体现出目的蛋白表达量的差别.

曲阳县17153362583： 什么时候选择线粒体内参抗体? ？
磨疮肝毒： 我们知道,在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参蛋白,这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达,由于内参在各组...

曲阳县17153362583： western blot 的一抗是内参抗体吗 - ？
磨疮肝毒： 内参抗体是个什么鬼? 一抗就是你要检测的目的抗体. GAPDH作为内参的话,也是要孵它的一抗

曲阳县17153362583： Western blot 内参跑不齐怎么调整 - ？
磨疮肝毒： 第一,应该确认每个样品表达GAPDH的量一样,虽然是持家基因,本人觉得不同细菌可能表达量不一样,造成信号强弱不一样.可以通过考马斯亮蓝染色来确定上样量的差异,调整上样量一样再检测GAPDH. 第二,内参跑不齐.一般是跑胶...

曲阳县17153362583： WB试验之如何选择内参抗体 - ？
磨疮肝毒： 你选择的目的蛋白位于什么地方~细胞核 胞质 线粒体~你要观察的是目的蛋白在哪一部分的含量~选择相应的内参~全细胞比如GAPDH HSP90AA1等~还有内参分子量要与目的蛋白分子量有一定差距~避免分不开~当然你可以选择不同种属的抗体来避免这个问题~

曲阳县17153362583： 血清western blot怎样选择内参 - ？
磨疮肝毒： 网络搜索了解到:1. 由于血浆或血清中很难找到一个稳定表达的蛋白,常见的在组织中比较常用的内参蛋白如肌动蛋白,GAPDH等,严格讲并不适合血浆或血清;2. 可以考虑用立春红染色 或考染做loading control(这种方法在不少文献中都有报道,是大家认可的)3. Blood上有些文章 用的是立春红染色做control

曲阳县17153362583： western blot等生物学试验中的内参是什么意思? - ？
磨疮肝毒：[答案] western blot用来检测蛋白表达的变化,而检测表达变化的前提就是,你每个孔跑得总蛋白量是相同的,如果上样量都不同,还怎么检测不同组间目的蛋白量的区别,这样内参就可以作为检测蛋白上样量是否相同的标准.内参一般选那...

曲阳县17153362583： western blot为什么要两次免疫反应 - ？
磨疮肝毒： 第一次免疫反应是为了让一抗结合目的蛋白,也可以说是让一抗特异性的识别出目的蛋白.达到检测的目的 第二次免疫反应时为了让二抗结合一抗,二抗上面有辣根过氧化物标记,结合一抗后就可以用ECL试剂反应,达到显影的效果经过两次免疫反应后最终检测出目的蛋白