大肠杆菌的分子克隆载体有哪些重要的结构特征
克隆载体主要是用于目的基因的拷贝,是用以复制扩大目的基因的工具,含有复制起点（ori）、多克隆位点（MCS）以及抗性基因位点.典型的如pUC19
而表达载体主要用以目的基因的转录,使目的基因编码的蛋白得以表达,除含有ori、MCS和抗性基因外,另有启动子（转录因子结合位点）、增强子、RBS（核糖体结合位点）等.典型的如pBR322
繁殖快，遗传物质少，结构简单
DNA片段的克隆需要合适的载体，载体或是质粒，或是噬菌体，或是病毒，通常大多经过人工改造[地的。作为载体必须具备两条件：一是该载体在细胞内必须能自主复制，即必须具备复制原点；二是该载体必须具备适合的酶切位点，且这些酶切位点不在复制原点区域内。以上两条，保证了载体的可繁殖性和可利用性。为了便于获得阳隆克隆，载体上常有筛选标记，如对抗菌素的抗性，某些基因产物的显色反应等。
一、质粒
常用的有pBR322，pUC系列质粒等。
（一）pBR322质粒是4362bp的环状双链DNA载体，有2个抗药性基因（四环素和氨苄青霉素），一个复制起始点和多个用于克隆 的限制酶切点。当缺失抗药性基因的大肠杆菌被pBR322成功地转化时，它便从该质粒获得了抗生素抗性。两个抗生素基因中均含供插入外源DNA用的不同的单一酶切位点。一般只选一个抗生素基因作为插入外源DNA之用。外源DNA插入后该抗生素抗性失活。另一抗生素抗性基因则作为转化细菌后筛选阳性克隆 之用。
（二）pUC系列质粒是2.7Kb的双链DNA质粒，有一个复制起点，一个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点，多克隆位点处于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷酶的氨基端片段，用pUC质粒转化LacZ基因有突变的大肠杆菌株（M15）时，因为由质粒表达的α－肽补充了大肠杆菌却失的α－肽，所以恢复了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和X-gal的培养基上，长出蓝色克隆。如果在多克隆位点内插入外源DNA，由于它破坏了α－肽的表达，因而在加入IPTG和X－gal的培养基，不能长出蓝色克隆，这就是所谓的蓝白筛选。
二、单链丝状噬菌体和噬粒
（一）大肠杆菌丝状噬菌体包括M13噬菌体f噬菌体等，其基因组 均是单链闭环DNA分子，其中M13mp系列克隆载体是对野生型M13加以改造，插入了多克隆位点和LacZ基因后的载体，所以也是可以利用IPTG和X-gal作蓝白筛选的，M13感染大肠杆菌后，即在菌体内酶的作用下，以感染性单链DNA（正链）为模板，转变为双链DNA，称作复制型DNA（RF DNA）。一般当每一个细胞内有100-200个RF DNA拷贝时，即停止复制，产生有感染性的完整的单链丝状噬菌体并分泌离开菌体。感染M13的大肠杆菌可继续生长，并不发生裂解，但生长速度则较正常菌慢，取感染M13的细菌培养液离心，即可从菌体中提取RF DNA，供限制酶切割等分子克隆操作之用；从离心后的上清液中，可用聚乙二醇（PEG）沉出噬菌体颗粒，提取单链DNA（ss DNA）供DNA序列分析，体外定位突变等使用。
（二）噬粒（phagemid）在质粒DNA中插入一段单链噬菌体的复制起始点DNA，即构成了噬粒，如pGEM-3Zf（-）就是一种噬粒。噬粒可像一般质粒一样操作，但当需要制备单链DNA时，就需要在培养时加入辅助噬菌体，常用的辅助噬菌体有M13KO7和R408。培养好的菌液在离心除去菌体后，上清中加入PEG即可沉出含有单链DNA的颗粒。噬粒也常用于DNA序列分析和体外定位突变。分子克隆常用载体除了上述两类以外，还有 噬菌体和粘粒，详细情况可参阅有关资料。
由于分子克隆载体的大小决定外源DNA插入片段的大小，两者呈反比关系，因而在建立载体时千方百计地减小载体分子量。对于穿梭载体，因为复制起点和标记基因具有生物特异性，所以载体上需要同时具有两个以上的复制起点和标记基因。
选择克隆载体的几个重要参数：
1、实验对象
2、实验性质
3、载体容量
4、 合适克隆位点
5、载体的稳定性
6、克隆载体的特点
实验对象：
1、供体：遗传背景与DNA特点等，其中包括染色体DNA大小，基因大小与结构，碱基组成，目的基因的产物特点以及遗传物质的传递方式等。
2、受体：各种中间宿主与终宿主的遗传背景，如遗传物质的传递方式（包括认为的方法），DNA限制修饰系统，DNA重组基因特点，基因产物修饰系统，即转录与翻译后修饰系统。
实验性质：
分子克隆的一般程序包括以下几步：
1、分离供体DNA或RNA（mRNA）和载体DNA
2、构建基因文库或cDNA文库
3、目的基因或cDNA克隆的筛选
4、目的基因或cDNA片段的鉴定：限制酶谱，次克隆，核苷酸序列分析，基因结构分析等
5、基因表达与调控机理的研究
克隆载体容量：
M13mp载体 <4 kb
细菌质粒载体 <10kb
λ载体 <23kb
cos质粒载体 <48kb
P1载体 <95kb
pEASY载体 ∽1000kb
合适的克隆位点：
单克隆位点和多克隆位点；单克隆位点的克隆载体就能够很方便的在基因上设计酶切位点，如pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆载体，双抗，无多克隆酶切位点；而多克隆位点的克隆载体中，酶切位点多，相对于实验来说也更容易。如pEASY-T1 Cloning Kit克隆载体，双抗性，酶切位点多。
克隆载体的稳定性：
克隆载体的稳定性决定着实验的成败，如果克隆载体在基因克隆过程中足够的稳定，而且能够多次的重复利用，那么此克隆载体的稳定性很好。如pEASY-T5 Zero Cloning Kit克隆载体的研发数据显示10kb目的基因可以稳定的连接。
克隆载体的特点：
不同品牌的克隆载体或多或少都有着不同的特性差异，即使基本的原理和作用都相同，但是一些细小的差别能决定着生物实验过程的成败。如pEASY系列的克隆载体就有着5min快速克隆，克隆稳定性极强，最大的一个特点是一般的克隆载体需要在中间的实验步骤加入T4连接酶，将目的基因和载体基因序列链接在一起，而pEASY系列克隆载体属于一体式克隆载体，在载体基因的两端就附带了“胶水”，能有效的使目的基因连接到载体基因上。
什么是大肠杆菌
肠埃希氏菌(E. coli)通常称为大肠杆菌,是Escherich在1885年发现的,在相当长的一段时间内,一直被当作正常肠道菌群的组成部分,认为是非致病菌。直到20世纪中叶,才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性,尤其对婴儿和幼畜(禽),常引起严重腹泻和败血症,它是一种普通的原核生物,根据不同的生物学特性将...
DNA分子复制是在哪儿进行的
分子遗传学者们利用分子克隆技术，分离出大肠杆菌染色体DNA复制起点oriC。它由422bp的DNA片段组成，其核苷酸序列已经搞清。其结构特点该为(1)在oriC区域内有一系列对称排列的反向重复序列，即回文结构(palindrome)，这表明区域与复制酶系统的识别有关(2)在oriC区中还有两个转录启动区(启动子)的核苷酸序列...
自杀载体的简介
自杀载体 例如那些基于CloE1样复制子的质粒。这类质粒只能在肠杆菌及关系很近的菌种中复制。其它形式的条件性复制载体有一个温度敏感复制子，或在必需基因内有一无义突变。自杀质粒应具备三个条件：⑵自杀质粒必须带有一个在整合到染色体内以后，可供选择的抗性标记。⑶自杀性质粒带有易于克隆的多克隆位点。
黄粉虫的开发利用
嚼噬作用增加了聚苯乙烯泡沫与微生物和胞外酶的接触面积,所摄食的碎片在肠道微生物所分泌的胞外酶作用下,进一步解聚成小分子产物;第三步,这些小分子产物在多种酶菌和黄粉幼虫自身酶的作用下,进一步降解并同化形成幼虫自身组织;第四步残留的泡沫碎片与部分降解中间产物,混合部分肠道微生物...
微生物对食品的污染途径有哪些
1967～1971年美国植物病毒学家Diener等发现马铃薯纺锤形块茎病的原原是一种不具有蛋白质的RNA ,分子量约为100,000,这类致病因子被称为类病毒 (Viroid)。随后在研究类病毒的过程中又发现一种引起苜蓿等植物病害的拟病毒(Virusoid) 。1982年发现引起羊搔痒病的病原为一分子量27KD的蛋白,称朊病毒(Virino)。1983年...
现在什么传染病最严重?
②IgM是分子量最大的免疫球蛋白,是个体发育中最先合成的抗体,因为它是一种巨球蛋白,故不能通过胎盘。血清中检出特异性IgM,作为传染病早期诊断的标志,揭示新近感染或持续感染,具有调理、杀菌、凝集作用。③IgA有两型即分泌与血清型。分泌型IgA存在于鼻、支气管分泌物、唾液、胃肠液及初乳中。其作用是将病原体...
基因工程包括哪些主要内容?
基因工程主要包括基因重组、基因组的改造、核酸序列分析、分子进化分析、分子免疫学、基因克隆、基因诊断和基因治疗等内容。基因工程是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、...
DNA是如何进行遗传复制的?(详细回答)
分子遗传学者们利用分子克隆技术，分离出大肠杆菌染色体DNA复制起点oriC。它由422bp的DNA片段组成，其核苷酸序列已经搞清。其结构特点该为(1)在oriC区域内有一系列对称排列的反向重复序列，即回文结构(palindrome)，这表明区域与复制酶系统的识别有关(2)在oriC区中还有两个转录启动区(启动子)的核苷酸序列...
自杀载体是不是在绝大部分细菌中不复制
这类质粒只能在肠杆菌及关系很近的菌种中复制。其它形式的条件性复制载体有一个温度敏感复制子，或在必需基因内有一无义突变。自杀质粒应具备三个条件：⑵自杀质粒必须带有一个在整合到染色体内以后，可供选择的抗性标记。⑶自杀性质粒带有易于克隆的多克隆位点。除一些特殊构建的用于G－的自杀质粒外，...
太适迪青： 作为基因工程载体的共有三类:质粒,动植物病毒,噬菌体的衍生物. 动植物病毒理论上是可以的,但从实际操作上来说质粒更常用.
盘山县18518356657： 大肠杆菌作为克隆载体有何优点 - ？
太适迪青： 繁殖快,遗传物质少,结构简单
盘山县18518356657： 分子克隆的方法 - ？
太适迪青： ①质粒:质粒是细菌染色体外遗传因子,DNA呈环状,大小为1-200千碱基对(kb).在细胞中以游离超螺旋状存在,很容易制备.质粒DNA可通过转化引入寄主菌.在细胞中有两种状态,一是“紧密型”;二是“松弛型”.此外还应具有分子...
盘山县18518356657： 在大肠杆菌表达目的基因,对载体有哪些要求? - ？
太适迪青： ○1载体能够独立复制 ○2 应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记 ○3应具有很强的启动子,能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别 ○4 应具有阻遏子 ,使启动子受到控制,只有当诱导时才能进行转录 ○5具有很强的终止子,以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因 ○6所产生的mRNA 必须具有翻译的起始信号,即起始密码AUG以和SD系便转录后能顺利翻译
盘山县18518356657： 大肠杆菌的表达载体有什么元件及生物学功能 - ？
太适迪青： 该表达载体由载体pRSET-A构建而来,所述载体pRSET-A中的氨苄青霉素抗性基因被卡那霉素抗性基因代替. 该表达载体可用于高效表达在制备7-氨基头孢霉烷酸时所需的酶而又不产生降低7-氨基头孢霉烷酸产率的β-内酰胺酶.
盘山县18518356657： 作为基因工程载体,其应具备哪些条件 - ？
太适迪青： 1、在宿主细胞中能保存下来并能大量复制,且对受体细胞无害,不影响受体细胞正常的生命活动. 2、有一定的标记基因,便于进行筛选.如大肠杆菌的pBR322质粒携带氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因,就可以作为筛选的标记基因.一...
盘山县18518356657： 大肠杆菌为什么被选为纯大肠杆菌 - ？
太适迪青： 大肠杆菌作为外源基因表达的宿主,遗传背景清楚,技术操作简单,培养条件简单,大规模发酵经济,倍受遗传工程专家的重视.目前大肠杆菌是应用最广泛,最成功的表达体系,常做高效表达的首选体系 在这里必须指出的是,处于生物安全...
盘山县18518356657： 大肠杆菌常作为基因工程的受体细胞是由于什么? - ？
太适迪青： 大肠杆菌常作为基因工程的受体细胞是由于繁殖速度快. 解析:大肠杆菌是细菌,属于原核生物,具有繁殖快、操作简便等优点.
盘山县18518356657： 表达菌,克隆菌问题 - ？
太适迪青： JM109,DH5a,TOP10是常用的克隆菌株 BL21是常用的表达菌株E. coli克隆菌株,种类非常多,常见的还有HB101,XL1-Blue等等,根据你克隆的方法和目的不同,有不同的选择.表达菌株我所了解的只有BL21和他的衍生菌株,像BL21(DE3)等等,其他的就不清楚了.如果你想知道更详细的,找本最新版的《分子克隆》,或者类似的书看看.
盘山县18518356657： 很多分子克隆用大肠杆菌做载体,表达出目的基因产物,再测产物结构,可是这样的产物结构应该和在真核生物体内表达出来的结构是不同的,两者的蛋白... - ？
太适迪青：[答案] 你是说要测蛋白质结构?倘若如此,考虑真核表达更好一些.很大一部分原核表达蛋白是为了制作抗体.因为在做抗体的时候蛋白质都是被切割成了一个个肽段,所以原核表达蛋白基本上都可以满足需求.
