有关酵母双杂交系统的几个问题
酵母双杂交实验有哪些常见问题和解决方法
可以采用以下方法解决：
1)
检测一下DNA的纯度,如果可以的话,重新用乙醇纯化.
2)
DNA-BD/诱饵蛋白很可能是有毒的.
3)
不适当的培养基,重新配制培养基,并做对照转化.
1、高敏感性。原因：
①采用高拷贝和强启动子的表达载体，使融合蛋白过量表达；
②激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物，之后又与启动子结合，此三元复合体使融合蛋白各组分间结合更趋于稳定；
③通过mRNA使信号放大；
④检测的结果是基因表达产物的累积效应，可检测存在于蛋白质间的微弱或暂时的相互作用。
2、真实性。检测在活细胞内进行，作用条件与作用力无需模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。
3、简洁性。融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和纯化蛋白质的繁琐步骤。
3、广泛性。采用不同组织器官细胞类型和分化时期的材料构建cDNA文库，能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质，适用于部分细胞质、细胞核及膜结合蛋白。
培养基温度太低,SD不要从冰箱中取出就用.
用枪时小心打出液体,枪头中留一点点液体.最好冲向容器壁,而不是直接冲向液体.
2.进行了两次质粒转化酵母均不成功，在30度温浴时震荡了，与这有关吗？
震荡? 上下颠倒就可以. DMSO对细胞壁有破坏作用.剧烈振荡的话,酵母会死掉的,另外 要选用进口的 carrier DNA, 质粒可以多加些.
酵母双杂交的局限性
⑴双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内， 而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等， 这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助， 这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。⑵酵母双杂交系统的一个重要的问题是假阳性...
酵母双杂交技术原理和步骤
酵母双杂交技术（YeastTwo-Hybrid）是一种用来研究蛋白质相互作用的实验技术。该技术利用酵母细胞的自身特性，使得两个蛋白质分别与介导转录激活的Gal4转录因子不同区域结合，从而激发酵母细胞内特定的报告基因（reportergene）的表达。当两个蛋白质的结合能够激活报告基因的表达，则表明这两个蛋白质之间存在...
酵母双杂交的常见问题
酵母双杂交系统应用中常遇到的问题一是假阳性较多，二是转化效率偏低。所谓假阳性就是：在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下，报告基因被激活。主要原因是由于BD融合诱饵蛋白有单独激活作用，或者这种融合蛋白的激活作用被外来蛋白激活。另外AD融合靶蛋白如果有DNA的特异性结合，则也可单独激活报告...
酵母三杂交系统与双杂交系统的区别
酵母三杂交系统具有快速且多用途的特点，提供体内检测的新方法。相较于双杂交系统，酵母三杂交系统在杂交RNA与杂交蛋白方面有所区别。首先，需要注意的是，杂交RNA分子并非总是生理结构，某些RNA组分的存在可能影响正常的分子结构。然而，Dhruba的研究揭示了局部稳定结构区，如MS2 coat protein和IRP1识别位点...
双杂交体系(two-hybrid system)
【答案】：是一种以酵母的遗传学分析为基础，研究反式作用因子之间相互作用对真核基因转录调控影响的实验系统。该系统由报告基因转录调控区、报告基因及一对可以相互作用的杂合反式作用因子组成。
酵母双杂交(Y2H)延伸系统
酵母双杂交的多种系统原理概括如下图所示，蛋白质X(深蓝色拼图块，诱饵构建体的一部分)和蛋白质Y(浅蓝色拼图块，猎物构建体的一部分)直接相互作用(装配拼图块)，从而诱导分裂蛋白质的重建(A、D、E中不同颜色的拼图块)、膜募集(B、C)或蛋白质二聚化(F)。诱饵或猎物结构中的蛋白质融合显示为拼图...
酵母双杂交诱饵载体的构建方法?
酵母双杂交是常用的蛋白质相互作用研究方法，其中诱饵bait和靶标prey蛋白质通过特定的载体表达系统与每个目标蛋白质进行相互作用实验。以下是构建酵母双杂交诱饵载体的一般步骤：选择适当的酵母双杂交系统：常用的酵母双杂交系统包括Gal4系统和LexA系统。选择适合你实验需要的系统。设计诱饵序列：诱饵是你感兴趣...
快问快答12| GAL4系统酵母双杂的原理
深入解析GAL4系统酵母双杂交的奥秘 在分子生物学研究中，GAL4系统酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid, Y2H）是一种强大的工具，用于检测和解析蛋白质之间相互作用。让我们逐一揭示其实验原理和关键步骤。原理揭秘 首先，GAL4系统的核心是真核生物中常见的转录激活因子GAL4，其结构独特，分为DNA结合域（BD, ...
酵母双杂交(探究蛋白质相互作用的新方法)
酵母双杂交是一种探究蛋白质相互作用的新方法。它利用酵母细胞内的转录因子结构域和DNA结合域，将两个蛋白质的结构域分别与两个不同的酵母细胞中的转录因子结合，从而使两个蛋白质相互作用，并被检测出来。酵母双杂交的操作步骤 酵母双杂交的操作步骤如下：1.构建酵母双杂交载体 首先需要构建酵母双杂交...
为什么要做gst-pulldown实验
因为此方法简单易行,操作方便。GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术,近年来越来越受到广大学者的青睐。其基本原理是将靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的...
示肿葛根：[答案] 1.在配置营养缺陷型培养基时,会有大量的气泡产生,这是为什么? 培养基温度太低,SD不要从冰箱中取出就用. 用枪时小心打出液体,枪头中留一点点液体.最好冲向容器壁,而不是直接冲向液体. 2.进行了两次质粒转化酵母均不成功,在30度温浴...
恩平市19242619244： 酵母双杂交的常见问题 - ？
示肿葛根： 酵母双杂交系统应用中常遇到的问题一是假阳性较多,二是转化效率偏低.所谓假阳性就是:在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下,报告基因被激活.主要原因是由于BD融合诱饵蛋白有单独激活作用,或者这种融合蛋白的激活作...
恩平市19242619244： 酵母双杂交系统有哪些优缺点 - ？
示肿葛根：[答案] 1、高敏感性.原因:①采用高拷贝和强启动子的表达载体,使融合蛋白过量表达;②激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物,之后又与启动子结合,此三元复合体使融合蛋白各组分间结合更趋于稳定;③通过mRNA使信号...
恩平市19242619244： 酵母双杂交的局限性 - ？
示肿葛根： 酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法, 有多方面的应用, 但仍存在一些局限性.⑴双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内, 而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等, 这些反...
恩平市19242619244： 酵母双杂交 - 酵母双杂交两种菌杂交效率不高有哪些原因? ？
示肿葛根： 酵母双杂交技术研究进展 张迪 霍克克 顾科隆 赵翔 李育阳 提 要 酵母双杂交技术是一种有效的真核活细胞内研究方法,在蛋白质相互作用的研究方面得到了广泛的应用并取...
恩平市19242619244： 酵母双杂交的特点 - ？
示肿葛根： 酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用,及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因.除上述的同仁回答外,还有其他的一些问题:假阳性较多,假阴性现象,转化效率也是关键点之一.
恩平市19242619244： 酵母双杂交系统有哪些优缺点 - ？
示肿葛根： 1、高敏感性.原因:①采用高拷贝和强启动子的表达载体,使融合蛋白过量表达;②激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物,之后又与启动子结合,此三元复合体使融合蛋白各组分间结合更趋于稳定;③通过mRNA使信号放大;④检测的结果是基因表达产物的累积效应,可检测存在于蛋白质间的微弱或暂时的相互作用.2、真实性.检测在活细胞内进行,作用条件与作用力无需模拟,在一定程度上代表细胞内的真实情况.3、简洁性.融合蛋白相互作用后,减少了制备抗体和纯化蛋白质的繁琐步骤. 3、广泛性.采用不同组织器官细胞类型和分化时期的材料构建cDNA文库,能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质,适用于部分细胞质、细胞核及膜结合蛋白.
恩平市19242619244： 酵母双杂交系统的介绍 - ？
示肿葛根： 酵母双杂交系统是将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子(如GAL4等)的DNA结合结构域基因和转录激活因子(如GAL4等)激活结构域基因,构建成融合表达载体,从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统.
恩平市19242619244： 酵母双杂交系统原理的应用 - ？
示肿葛根： 酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用,具有高度敏感性. 主要是由于: ①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达. ②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行, 而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤,降低了信号强度. ③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强,后者又与启动子DNA结合, 此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定. ④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大. 同时, 酵母表型, X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感.
恩平市19242619244： 酵母双杂交 为啥一个方向有作用另一个方向没有 - ？
示肿葛根： 酵母双杂交系统是目前最为广泛的一种蛋白质相互作用研究方法,其中,从cDNA文库中筛选出与已知蛋白存在特异相互作用的蛋白是酵母双杂交系统最为重要和广泛的用途.酵母双杂交系统已发展成为鉴定和检测蛋白质相互作用的一种标准方法,在蛋白质相互作用关系的研究中扮演着非常重要角色.
