普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的 基本原理和操作步骤（三）
反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列，因此又可称为染色体缓移或染色体步移。这时选择的引物虽然与核心DNA区两末端序列互补，但两引物3’端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子，通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段；现已制备了酵母人工染色体（YAC）大的线状DNA片段的杂交探针，这对于转座子插入序列的确定和基因库染色体上DNA片段序列的识别十分重要。
PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，反向PCR可扩增中间一段已知序列，而两端序列未知的基因片段不扩增。
反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列，因此又可称为染色体缓移或染色体步移。这时选择的引物虽然与核心DNA区两末端序列互补，但两引物3’端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子，通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段；现已制备了酵母人工染色体（YAC）大的线状DNA片段的杂交探针，这对于转座子插入序列的确定和基因库染色体上DNA片段序列的识别十分重要。
该方法的不足是：①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。
利用反向PCR可对未知序列扩增后进行分析，探索邻接已知DNA片段的序列，并可将仅知部分序列的全长cDNA进行分子克隆，建立全长的DNA探针。适用于基因游走、转位因子和已知序列DNA旁侧病毒整合位点分析等研究。
用传统的缓冲液和其他提供者推荐的条件裂解DNA。反向PCR所扩增的片段的大小由 PCR扩增片段的大小决定，目前，PCR扩增的实际上限为3-4kb。在许多情况下，首先 需要进行Southern杂交来确定内切酶用以产生大小适于环化及反向PCR的片段的末端 片段。能裂解核心区的内切酶使反向PCR只能扩增引物所定模板(依赖于引物)的上游 或上游区，而不裂解核心区的酶则使两上边侧序列都扩增，并带有由内切酶和环化类 型决定的接点(例如，互补突头连接与钝头连接)。对于扩增左翼或右翼序列，初试时 最好靠近识别上个碱基位位的酶，并已知在核心区有其方便的裂解位点。如果用反向 PCR从含有大量不同的克隆片段的同一载体中探测杂交探针，建议事先在载体中引入 合适的酶切位点。
用T4连接酶在稀DNA浓度下环化更容易形成单环。在一些实验中，为产生对反向 PCR大小适当的DNA片段需要两种内切酶，但这样所产生的片段末端则不适于连接，环 化前需用Klenow或噬菌体T4DNA聚合酶修理(钝化)。连接前，需用酚或热变性使内切 酶失活。
聚合酶链反应条件与经典所用的相同，例如，94℃-30秒变性，58℃-30秒引物退火， Taq聚合酶70℃延伸3分钟，进行30个循环。可改变PCR条件以生产特异产物。将反向 PCR用于测序时，与核心区末端后部结合的扩增引物更为有用，它使测序引物扩增部 分的核心序列与未知边侧序列间的接点更近，减少了扩增引物的干扰。
描述一种大聚合酶链反应应用的方法，使在已知序列的核心区边侧的未知成几何级数扩增。用适当的限制性内切裂解含核心区的，以产生适合于扩 增大小的片段，然后片段的末端再连接形成环状分子的引物同源于环上核心区 的末端序列，但其方向性，使链的延长经过环上的未知区而不是分开引物的核心区。这种反向方法可用于扩增本来就在核心区旁边的序列，还可应用于制备未知序列 探针或测定边侧区域本身的上、下游序列。
一般常见的PCR仪有哪几种类型?
常见的PCR仪有四种类型，分别是普通基础PCR仪，梯度PCR仪，实时荧光定量PCR仪和原位PCR仪。可百度康高特，有详细资料参考。
PCR仪有哪些种类,如何选购?
【PCR仪的种类】分类总是五花八门，总体来说可以分为PCR扩增仪和实时荧光PCR仪两大类，有人也把它们称为半自动和全自动，或者定性和定量，都是比较不准确的称呼。PCR最重要的就是个升降温过程，最初的水浴锅式PCR，就是三个水浴箱，一个机械臂，定时抓出反应槽转换水浴锅。这种东东体积大，迅速慢...
以PCR为基础的相关技术有哪些?
● 原位PCR 直接法：使用标记（放射性同位素、生物素、地高辛、荧光素等）的引物或脱氧三磷酸核苷酸（如dUTP）进行PCR扩增，则标记物掺入到PCR产物中。最后用放射自显影、免疫组化或荧光法检测 PCR产物及其在细胞内位置。间接法：先进行细胞内DNA的原位扩增，然后用标记的核酸探针进行原位杂交。● 荧光...
万字干货,关于PCR基因扩增仪的一切
基因扩增仪以其高灵敏度和简便性，被广泛应用于医学检测、DNA鉴定、药品研发和成分分析。分类与应用传统PCR仪与梯度PCR仪在退火温度控制上有区别，原位PCR则直接在细胞内进行。实时荧光定量PCR仪如赛默飞的CFX系列和Eppendorf的Mastercycler系列，提供金属板式、离心式和独立控温等多种选择，各有其独特优势。...
简明扼要讲一下Southern blotting,PCR,原位杂交
Alwine等八以上类似方法用于检测经琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳中分离的特定RNA，此方法又称为Northern Blotting（Northern印迹）；1979年Towbin等再将该方法扩展到特定的蛋白质检测或分析上，成为Western Blotting（Western 印迹）PCR：（聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR）PCR技术的基本...
普通RT-PCR的引物和原味杂交的引物可以通用吗?
只要你引物特异性还行，引物是可以通用的，但原位貌似要先连到一个中间载体上，然后用载体上的引物从载体上扩增下来回收后再标记的
用PCR检测HPV准确吗
PCR是核酸扩增技术的一种检测,提取HPV病毒的遗传物质(核酸),然后进行加速扩增,可以将正常情况的分裂周期加速,属于分子学检测范畴,敏感度和准确性都优于酶联免疫法(ELISA法),应该在目前是属于最准确先进的.Fish检测我也不懂,网上拷的,如下:FISH是缩写，即fluorescence in situ hybridization (FISH) ，...
清洁pcr仪的反应槽和热盖
目前常用的技术，可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。现在PCR技术已经被广泛地应用于生命科学研究、食品卫生、医疗、法医及环境监测等诸多方面。pcr仪的工作原理是利用升温使DNA变性，在聚合酶的作用下使单链复制成双链，进而达到基因复制的目的。pcr仪的分类有普通的PCR仪、梯度PCR仪、原位PCR...
DNA合成仪与PCR仪有什么区别?
“简单的说，PCR就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内In Vitro的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制。目前常用的技术，可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。根据DNA扩增的目的和检测的标准，可以将PCR仪分为普通PCR仪，梯度PCR仪，原位PCR仪，实时荧光定量PCR仪四类...
【科普】关于基因检测,不得不说的事儿!
从基因诊断的技术类型来看，可以将其粗略分为聚合酶链式反应（PCR）、荧光原位杂交（FISH）、基因测序以及基因芯片技术。 其中的PCR技术虽然只能检测一个或多个基因，但其操作简单快捷，已经成为很多医院和独立实验室的标配；而FISH则主要用于细胞遗传领域，如癌症检测、产前检测等，精确度和灵敏度相对较低；...
孟菲银耳：[答案] 热启动PCR Touch-down PCR RT-PCR 兼并引物PCR 巢氏PCR 反向PCR 不对称PCR 原位PCR 连接酶链反应 RACE-PCR AFLP 免疫-PCR(immuno-PCR) MSP甲基化特异PCR
惠水县19779939535： PCR技术有哪些用途 - ？
孟菲银耳： 1、核酸的基础研究:基因组克隆 2、不对称PCR制备单链DNA用于DNA测序 3、反向PCR测定未知DNA区域 4、反转录PCR(RT-PCR)用于检测细胞中基因表达水平、RNA病毒量以及直接克隆特定基因的cDNA 5、荧光定量PCR用于对PCR产物实时监控 6、cDNA末端快速扩增技术 7、检测基因的表达 8、医学应用:检测细菌、病毒类疾病;诊断遗传疾病;诊断肿瘤;应用于法医物证学
惠水县19779939535： pcr技术扩增 - ？
孟菲银耳： PCR(聚合酶链式反应)是利用DNA在体外摄氏95度时解旋,55度时引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至72度左右DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链.由PCR技术制造的PCR仪实际就是一个温控设备,能...
惠水县19779939535： 基因工程的操作技术 PCR技术,反PCR技术 - ？
孟菲银耳： 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,简称PCR)又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术.利用DNA的半保留复制原理经由变性--退火(复性)--延伸三个基本反应步骤构成,理论上经过30个循环就可以使DNA扩增至10亿倍.反转录PCR是将RNA的反转录和以反转录产物cDNA为模板的聚合酶链式扩增相结合的技术.首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的DNA片段.RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因的表达水平,细胞中RNA病毒含量和直接克隆特定基因cDNA序列等研究.
惠水县19779939535： 反向pcr的原理 - ？
孟菲银耳： 反向PCR(reversePCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段,而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA.
惠水县19779939535： 什么是原位、梯度、定量、普通PCR? - ？
孟菲银耳： 原位PCR 就是在组织细胞里进行PCR反应,它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点,是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术.原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞,又能标出靶序列在细...
惠水县19779939535： 不同种类PCR各需要什么样的PCR仪呢?哪些种类用普通的PCR仪就可以呢? - ？
孟菲银耳： 如果想摸索PCR退火条件,当然是梯度PCR最方便了(没有也可以,就是多做几次,费时费力),如果是想做定量,肯定是荧光定量PCR仪了.还有原位PCR仪,一般是在玻片上做的.至于重组PCR,降落PCR等,普通PCR仪就行了.
惠水县19779939535： 反向pcr和反式pcr一样么?很纠结反式PCR到底是反转录PCR还是反向PCR - ？
孟菲银耳： 反式PCR,或者称反转录PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)、逆转录PCR,是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形.在RT-PCR中,一条RNA链被逆转录成为互补DNA,再以此为模板通过PCR进行DNA扩增.PCR只能扩增两端序列已知的基因片段,反向PCR可扩增一段已知序列的两端未知序列. 反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA,也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA.反转录PCR是将mRNA转录成cDNA.反向PCR是一种用已知核酸区域去扩增两侧未知区域的PCR方法.实时PCR是定量PCR的方法.
惠水县19779939535： 反向PCR怎么做 - ？
孟菲银耳： 反向pcr(inverse pcr)反向pcr是一种多聚合酶链式反应(pcr)应用的方法,可使已知序列的核心区边侧的未知rma成几何级数扩增.用适当的限制性内切裂解含核心区的rma,以产生适合于pcr扩增大小的片段,然后片段的末端再连接形成环状分子.pcr的引物同源于环上核心区的末端序列,但其方向可使链的延长经过环上的未知区而不是分开引物的核心区.这种反向pcr方法可用于扩增本来就在核心区旁边的序.
惠水县19779939535： 求反向PCR(inverse pcr)的步骤 - ？
孟菲银耳： 反向PCR程序用传统的缓冲液和其他提供者推荐的条件裂解DNA.反向PCR所扩增的片段的大小636f7079e799bee5baa631333231393032由 PCR扩增片段的大小决定,目前,PCR扩增的实际上限为3-4kb.在许多情况下,首先 需要进行...
