病毒的血清学技术有什么作用？

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这是检测病毒的有效办法。血清学诊断和鉴定病毒的方法很多，常见的有ELISA（酶联免疫吸附法）、免疫电镜、琼脂双扩散、免疫电泳等。其中，ELISA（酶联免疫吸附法）为世界公认的植物病毒检测方法。应用抗血清鉴定植物病毒的亲缘关系，检测花卉的种子、鳞球茎和苗木中传带的病毒，是植物病毒检疫和检测上常用的快速鉴定和检验技术，经常和生物学、电镜技术等配合使用。

血清学反应的原理是人或高等动物对于侵入自身的有些异体物质产生免疫反应，即异体物质刺激淋巴组织产生相应的球蛋白称为抗体，能刺激机体产生抗体的异物称为抗原，抗原与其相对应抗体可以在机体内或机体外进行特异性反应，这种反应可以被用来预防疾病（人或动物）、鉴定和检测病原物。

抗原的分子具有许多化学活性基团，称为抗原决定簇，它们的一定结构决定了抗原的特异性。一般来说，抗原决定簇数目愈多，抗原性就愈强。植物病毒是核蛋白，外壳由许多亚基组成，抗原决定簇位于亚基上。植物病毒是良好的抗原，其蛋白外壳，尤其是外壳的表面起着抗原的作用；单链核酸虽不能作为抗原，但它与外壳蛋白同时存在时，能增强外壳在动物体内的免疫反应；一般来说，植物病毒比其寄主的正常植物蛋白有更强的抗原性。

抗体是动物机体受到抗原刺激后，由动物机体的免疫活性细胞产生的免疫球蛋白，通常以“Ig”来表示。在抗体中至少含有5种免疫球蛋白，即IgG，IgM，IgD和IgE，其中以IgG最主要，约占70%～90%。IgG为易弯曲的Y形分子。由4条多肽链（2条重链和2条轻链）借4个2硫链连接组成。链的一端为氨基端，另一端为羧基端，酶可以降解IgG成为断片。常用木瓜酶和胃酶。前者将IgG降解成Fab和Fc两种片段；后者降解为F（ab）2和FC两种片段。Fab片段有抗体活性，1个Fab与1个抗原分子结合；F（ab）2为双体，可与2个抗原分子结合。抗体存在于免疫动物的血清或体液中。

植物病毒的抗血清，是将病毒的提纯液作为抗原，一般以家兔，有时也以小鼠或母鸡等为免疫动物，通过静脉、肌肉或腹腔等途径，逐渐增加剂量，多次注射抗原。待抗体产生后，采血，取出其血清即为该病毒的抗血清。免疫家兔产生的抗血清称为兔抗体；免疫小鼠产生含特异抗体的腹水，采收的腹水，内含“腹水抗体”；免疫母鸡，产生含抗体的鸡蛋，从蛋黄中提取的抗体称为“蛋黄抗体”。运用细胞融合技术，将小鼠骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞杂交，产生杂交瘤细胞，其增殖能力很强，可在体外连续培养产生抗体。选择其中能产生某单一抗体的细胞株，所产抗体称“单克隆抗体”。单克隆抗体开创了在动物体外产生抗体的新时代。

这里介绍几种常用的血清学检测技术。

1 免疫双扩散法

又称奥氏琼脂双扩散法。琼脂在水中加热溶解，冷却时成为凝胶平板，在上打数孔，分别放入抗原和抗体，它们各自向凝胶中扩散，于抗原和抗体比例最适的位置上形成沉淀反应。

具体步骤：按每1～2g（一般用1.2g）琼脂粉，于100ml生理盐水中，置沸水浴或家用高压锅中溶化，配成1%～2%琼脂，加0.1%叠氮化钠，防腐，用吸管或其他物品，将琼脂均匀地铺于洁净的玻璃平板（可用载玻片或裁制成的大小一致的玻板）上，以热的琼脂液刚铺满为限，约1.5～2mm厚，静止待凝固，制成的琼脂板置保湿器皿中待用。检测时，琼脂板下放一“孔排列图”，用打孔器按图样打孔。孔的排列方式很多，有梅花形，有7孔，即中间1孔，四周6孔；方阵形，有5孔，即中间1孔，四周4孔（图1）。打出孔后，用针或吸器将孔中凝胶圆片取出，在孔中加适宜稀释度的抗原或抗体，抗原孔中应包括已知阳性抗原、待测抗原和健株对照，可以用病健株的汁液或提纯病毒液。加满各孔，持平放于保湿器中数小时或放置至次日，在有黑背景的散射或斜射灯光上方观察沉淀线。抗原和抗体的适宜浓度是影响反应结果的主要因素，因此必须注意：第一，孔径和孔距（相邻两孔边的最短距离）要适宜，两者之比以2∶1为宜，即孔距等于孔的半径，孔距过大，沉淀线便不能出现或变模糊，并且反应时间拉长，不能很快见到结果；第二，掌握反应物的最适浓度，为此，对所用抗体或抗原，分别作倍比稀释，先测知两者反应的最适浓度后，再进行正式反应。

图1 打孔图样

免疫双扩散实验可以用于鉴定抗原与抗体是否具有特异性和确定两个抗原是否相同。在抗原与抗体之间出现沉淀线说明抗原与抗体为特异相关。见图2。

图2 抗原与抗体之间出现的沉淀反应

如TMV抗血清与某一未知感病材料汁液发生沉淀反应，说明此感病材料含有TMV。

比较两个抗原是否相同，有三种情况（图3）：①抗原相同：甲抗原与甲抗体形成特异沉淀线，而相邻的乙抗原也形成沉淀线，两条线连成一条，说明甲乙两抗原相同。②抗原部分相同：甲和乙抗原虽均产生沉淀线，两线成分枝状连结，说明乙抗原的沉淀线只与甲抗原相连，表明两抗原仅有部分相同。③抗原不同：甲乙两抗原的沉淀线呈交叉状，说明两者抗原性完全不同。

图3 抗原与抗体之间出现的沉淀反应用于比较两个抗原

免疫双扩散实验已广泛用于植物病毒的鉴定、检测、研究病毒间的亲缘关系和测定抗体的效价等。具有操作简单、省时、省样和鉴别能力强等优点，特别适用于球状和直杆状病毒。长线状病毒，易凝集，难以在琼脂中扩散，必须在反应前加SDS降解病毒粒体后，才能获得较好结果。

2 免疫电泳

免疫电泳是将免疫扩散和电泳结合在一起的一项实验技术。可以把组分复杂的抗原，通过电荷和泳动速度的不同而分开，从而增加了鉴别能力。常用的方法有对流免疫电泳和平板电泳。

对流免疫电泳是抗原和抗体相对排列（图4），置于一定电场中，以碱性缓冲液为电解质时，抗原所带负电荷多于抗体，因而抗原向正极移动；而抗体虽也有微弱的向正极移动的力量，但处于较强的电渗作用下，它反而略向负极移动。两者在电场作用下约泳动15min便可在两者之间出现沉淀线。对流免疫电泳比琼脂双扩散的反应速度快，适用于大量样品的快速检测。

图4 对流免疫电泳抗原和抗体排列图

具体步骤：用0.025mol/L硼酸缓冲液（pH8.6）或0.05mol/L TrisM缓冲液（含EDTA）配制1%～1.2%琼脂，铺板，排列抗原和抗体。抗原和抗体孔的孔距同孔的直径，抗原和抗原（抗体和抗体）的孔距等于孔的半径。测定中，必须设已知阳性抗原液为阳性和健康原液为阴性对照。琼脂板放电泳槽，槽中加入上述缓冲液，用滤纸使板的两端与槽中缓冲液相连。10～12V/cm，电泳20～30min，观察结果。

平板免疫电泳是在一块琼脂平板上，先电泳抗原，使其不同组分分开，再进行免疫双扩散反应。具体步骤：在琼脂板上打出抗原孔，放入待测抗原、阳性和健康对照。10～12V/cm电泳1～2h，取出，按图5在两抗原孔之间挖一条宽约2mm的槽，孔槽间的距离与孔直径相同。槽中放满抗血清。平放于保湿器皿中，过夜，观察结果。

图5 平板免疫电泳抗原和抗体排列图

3 酶联免疫吸附测定法