如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养
所谓克隆化培养就是扩大培养，也就是增加杂交瘤细胞的数量，可以提高单克隆抗体的产量，这里的克隆指的是无性繁殖，与克隆羊多莉是不同的。通俗的讲就是指杂交瘤细胞在一定的培养基中进行有丝分裂，产生大量的相同的都可以产生单克隆抗体的细胞
1、免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的 过程。 一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。 抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。
2、细胞融合 采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。 将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。
3、选择性培养 选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。 未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。 只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。
4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化 在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。
5、单克隆抗体的大量制备 单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。
(1)体内诱生法 取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。
(2)体外培养法 将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。
经选择性培养基筛选后的杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔细胞培养板上培养，使每孔细胞不超过一个（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。
阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。
融合后的细胞经过hat培养基选择后，只有杂交瘤细胞可以存货。但是，选出的杂交瘤细胞不一定就是能分泌研究者所需特定抗体的杂交瘤细胞。未将这些具有不同抗原特异性的杂交瘤细胞逐个分离，目前可用的方法有：有限稀释法、显微操作法、半固态凝胶介质中培养并挑选克隆及荧光激活细胞分选仪等，其中常用有限稀释法来选择。该方法是将杂交瘤细胞，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。在对各孔上清液中细胞分泌的抗体进行检测。
如果某孔内上清液中的抗体可与特定抗原结合，则定为阳性孔。但是，阳性孔中的细胞不能保证是单细胞，可能既有能产生特定抗体的杂交瘤细胞，又有其他杂交瘤细胞。对此，要挑选阳性孔中的细胞继续进行有限稀释。一般要进行3次~4次，直到确定每个孔增殖的细胞为单克隆细胞。此过程为克隆化培养。一旦获得所需要的杂交瘤细胞系，即用组织培养法和活体法对其进行扩增后，在196℃的液氮中长期冻存，随时取用。
杂交瘤细胞是如何制备的?
这种既能产生抗体又能繁殖的杂交瘤细胞是这样制备的:首先将抗原(某一病菌)不断地注射给小鼠,使小鼠的脾脏生产能抵御病菌的B淋巴细胞?接着将B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞放在一个培养皿里培养,并加入融合剂,使两种细胞融合形成许多杂交瘤细胞?然后从这些杂交瘤细胞中经过多次的培养筛选,最后筛选出由一个杂...
杂交瘤细胞杂交瘤细胞的制备
制备阳性杂交瘤细胞的步骤如下：1. 瘤细胞培养：骨髓瘤细胞通常悬浮生长，如需分离，轻轻吹打或敲击培养瓶。保持细胞在指数生长期，每3-5天增殖后，将细胞稀释至5×10^4-10^5\/ml，使用高糖DMEM培养液，添加HEPES维持pH稳定。2. 免疫小鼠和脾细胞准备：选择6-8周龄Balb\/C雌鼠，进行免疫和脾细胞制...
杂交瘤细胞系的产生与筛选?
脾B细胞+骨髓瘤细胞，加聚乙二醇（PEG）促进细胞融合，HAT培养基中培养（内含次黄嘌呤、氨基蝶呤、T）生长出来的脾B-骨髓瘤融合细胞继续扩大培养。细胞融合物中包含：脾-脾融合细胞：不能生长，脾细胞不能体外培养。骨-骨融合细胞：不能利用次黄嘌呤，但可通过第二途 径利用叶酸还原酶合成嘌呤。氨基...
如何制备杂交瘤细胞?
简单描述就是：将两个细胞（例如 B淋巴细胞和骨髓瘤细胞）通过诱导融合形成杂交细胞，具体操作时为了提高成功率会用多个细胞同时杂交，然后筛选出目的细胞，再进行细胞培养使其有丝分裂而增值，得到大量目的细胞（杂交瘤细胞）。实际操作步骤复杂且要求严格，如果没有配套专业设施，一般人很难成功的～融合操作...
在将杂交瘤细胞进行扩大培养前需要经过什么过程
用8-氮鸟嘌呤（一种嘌呤类似物）来对瘤细胞进行筛选，它可以参与核酸合成的旁路途径，但是由此合成出来的核酸不能具备正常核酸那样的功能，因此这种细胞就都会死去，能存活下来的细胞都是不能进行旁路合成核酸，该过程的本质就是为了筛选出HGPRT缺陷型细胞株。HGPRT缺陷型细胞株与B细胞进行融合，融合后的...
杂交瘤技术的原理
正常的脾细胞在培养基中仅存活5～7d，无需特别筛选；细胞的多聚体形式也容易死去；而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。细胞DNA合成一般有两条途径。主要途径是由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经次...
杂交瘤细胞怎么制备?
在PEG（聚乙二醇）之类的物质作用下进行细胞融合。 然后是，第一次筛选，选的是骨髓瘤与效应B细胞的杂交瘤细胞，也就是单克隆抗体。 再来是第二次筛选，选的是能产生所需要的特异性抗体的杂交瘤细胞。绝对不能用T细胞 T细胞分泌的是淋巴因子 既不能达到抗体的目的 而且还会消灭瘤细胞 ...
淋巴细胞杂交瘤的形成原理是什么?并简述其制备路线
流程：将有用抗原免疫过的淋巴细胞与骨髓瘤用PEG进行杂交融合。1）把融合的细胞在HAT培养基上选择出来。2）将选择后的整合细胞分散，培养成杂交瘤细胞。3）使能产生单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆化。4）杂交瘤细胞抗体的性状的鉴定。5）单克隆抗体的大量制备，一是在培养液中大更是繁殖，二是注入纯系...
杂交瘤细胞是将小鼠的哪两种细胞融为一体?( )
杂交瘤技术的原理是利用聚乙二醇（PEG）为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞（能分泌抗体）与具有体外长期繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体，在HAT选择性培养基的作用下，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经过反复的免疫学检测、筛选和单个细胞培养（克隆化），最终获得既能产生所需单克隆抗体，又能长期繁殖...
杂交瘤细胞筛选
H)、氨基蝶呤(A)、胸苷(T)配置，其中氨基蝶呤(A)能阻断dna合成的主要途径，而用于杂交的瘤细胞都是次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)或胸苷激酶(TK)活性缺陷细胞，而脾细胞中有这种酶，所以骨髓瘤细胞和瘤-瘤细胞会无法合成dna死去，而脾细胞和脾-脾都知道会无法无限长时间存活而死去，本人纯手打 ...
诸葛玉甲泼： 融合后的细胞经过hat培养基选择后,只有杂交瘤细胞可以存货.但是,选出的杂交瘤细胞不一定就是能分泌研究者所需特定抗体的杂交瘤细胞.未将这些具有不同抗原特异性的杂交瘤细胞逐个分离,目前可用的方法有:有限稀释法、显微操作...
和龙市19517394540： 如何从杂交瘤细胞中获取抗体基因 - ？
诸葛玉甲泼： 如何从杂交瘤细胞中获取抗体基因 原因比较多,首先你要确定你师兄是不是从该杂交瘤获得的抗体,获得的抗体量多不多?然后,如果确实是这株杂交瘤,那么你要从两方面着手:一,富集一下上清里面的抗体或者考虑下抗原的包被量,有可能...
和龙市19517394540： 单克隆抗体的制备筛选出的杂交瘤细胞应该直接在体外培养还是注射到小 ？
诸葛玉甲泼： 单克隆抗体制备有两种方法. 第一种方法是:增量培养法,即将杂交瘤细胞在体外培养,在培养液中分离单克隆抗体.该法需用特殊的仪器设备,一般应用无血清培养基,以利于单克隆抗体的浓缩和纯化. 第二种也是最普遍采用的方法是小鼠腹腔接种法.选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠,先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射,一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去.通常在接种一周后即有明显的腹水产生,每只小鼠可收集5~10ml的腹水,有时甚至超过40ml.该法制备的腹水抗体含量高,每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平.此外,腹水中的杂蛋白也较少,便于抗体的纯化.接种细胞的数量应适当,一般为500000/鼠,可根据腹水生长情况适当增减.
和龙市19517394540： 简述人工制备单克隆抗体的方法? - ？
诸葛玉甲泼： 单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体.通常采用杂交瘤技术来制备,杂交瘤(hybridoma)抗体技术是在细胞融合技术的基础上,将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤...
和龙市19517394540： 单克隆抗体的鉴定实验 - ？
诸葛玉甲泼： 1.杂交瘤细胞染色体的检查采用秋水仙素裂解法进行.2.单克隆抗体的类型、亚型的测定:购买兔抗小鼠Ig类型和亚型的标准抗血清,采用琼脂扩散法或ELISA夹心法测定单抗的Ig类型和亚型. ELISA夹心法测定单抗的Ig类型和亚型的试剂盒说明...
和龙市19517394540： 单克隆抗体制备过程中的专一抗体检测阳性的检测原理是什么 - ？
诸葛玉甲泼： 2.杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞,只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞,因此,必须进行筛选和克隆化.通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养.采用灵敏、快速、特异的免疫学方法,筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞,并进行克隆扩增.经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后,及时进行冻存.抗原-抗体杂交原理
和龙市19517394540： 单克隆抗体中得到了杂交瘤细胞后为什么还要进行杂交瘤细胞的筛选? - ？
诸葛玉甲泼： 同样是杂交瘤细胞,但不同效应B细胞与骨髓瘤细胞融合得到的杂交瘤细胞产生的抗体是不同的,所以还要筛选出产生特定抗体的杂交瘤细胞.
和龙市19517394540： 融合细胞需要用什么培养基进行筛选,并进行科隆化培养和什么 - ？
诸葛玉甲泼： 融合细胞需要用什么培养基进行筛选 单克隆抗体制备过程中,骨髓瘤细胞和b淋巴细胞融合后,要用特定的培养基筛选出杂交瘤细胞. 筛选得到的杂交瘤细胞还需进行克隆化培养和抗体检测,经多次筛选,就可获得足够数量的能分泌所需抗体的...
和龙市19517394540： 单克隆抗体的制备流程是怎样的 - ？
诸葛玉甲泼： 1.对小鼠注射特定的抗原蛋白,使小鼠产生免疫反应; 2.得到相应的B淋巴细胞; 3.将小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合,再用特定的选择培养基进行筛选; 4.在该培养基上,未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡,只有融合的杂种细胞才能生长(这种杂种细胞的特点是既能迅速大量繁殖又能产生专一的抗体); 5.对上述杂交瘤细胞还需进行克隆化培养和抗体检测,经多次筛选,就可获得足量的能分泌所需抗体的细胞; 6.最后,将杂交瘤细胞在体外条件下做大规模培养,或注射到小鼠腹腔内增殖,这样,从细胞培养液或小鼠腹水中,就可以提取出大量的单克隆抗体了!
