免疫组化实验染色的注意事项及影响因素有哪些？
1、 标本的固定
组织标本及时的取材和固定是做好免疫组化染色的关键第一步，是有效防止组织自溶坏死，抗原丢失的开始。离体组织应尽快的进行取材固定，最好20分钟内，因为有些抗原若固定不及时可能就检测不到了。而对于固定液的选择，原则上讲，应根据抗原的耐受性来选择相应的固定液，但在病理常规工作中很难做到这一点，因为病理的诊断和鉴别诊断都是在常规HE病理诊断的基础上决定是否进行免疫组化的染色，而HE染色的常规组织处理是采用10%的中性缓冲福尔马林或4%缓冲多聚甲醛进行组织固定，利用其渗透性强，对组织的作用均匀进行固定。组织固定时间最好在6-24小时内，一般组织固定时间不应超过24小时，随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。另外，非中性福尔马林缓冲液、含酸和含汞固定液亦可导致标记失败或减弱。
2、 蜡块的选择
正确选择用于免疫组化的蜡块也是确保染色质量的关键因素之一。很多病例的组织蜡块不止一个，不同的蜡块中，组织成分常常并不完全一样，一般选择最具代表肿瘤特异性的蜡块，最好含有内对照。更值得注意的是，所选取的蜡块除了要包含代表肿瘤特异性的组织外，应尽量避免含有出血、坏死和脂肪组织。这些组织内的抗原大多已被破坏或丢失，最终通常呈片状弥漫染色，除影响制片的美观外，容易导致误判或误诊。而且这些组织通常影响切片的质量。另外，最好不要选择冰冻剩余组织或脱钙组织，冰冻或脱钙一般也会影响组织内的抗原。
3、 修复方法的选择和对比
抗原修复是指石蜡切片免疫组化染色前用酶、表面活性剂或微波、金属盐等对被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原进行暴露和修复，使抗原性得到一定程度的恢复过程。修复的方法有酶（胰酶、蛋白酶等）消化、加热法（水浴、微波和高压煮沸等）和超声处理等，或者综合利用以上方法。目前最常用的是加热煮沸法，少数用酶消化法。大量实验表明，固定时间越长的标本，所形成的交联就越紧密，抗原就越难以被激活，所需的修复强度也就越强。各种修复方法染色强度的比较为：高压法>水浴法>微波法。在日常工作中，要根据不同抗原的特性选择合适的修复方法。抗原修复液常用的有枸橼酸缓冲液（pH 6.0）、EDTA缓冲液（pH 8.0～9.0）等。修复液的PH值对染色结果也会产生相当大的影响。研究发现在高PH值约pH8.0～9.0时，都有较好的染色结果，所以目前比较推崇的抗原修复液为高PH值的修复液，尤其是对核阳性的抗体。
4、 确定阳性对照
免疫组化染色过程比较复杂、影响因素也很多，故应设置阳性对照和阴性对照。尤其是阳性对照尤为重要。阳性对照包括两种，一种为内对照，这是一种比较理想的对照，对照和测试组织都在同一张切片中，都处于相同的实验条件下，结果更可靠也更具有可比性。另一种称为外对照，有时在测试的切片中不存在已知的抗原，如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤，在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原，如果病变出现阳性反应结果，尚能提示是恶黑，但是如果出现阴性结果，就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原，还是技术问题。因此，应另外设立一个已知的阳性对照。另外，比较简单的方法，是采用阑尾作为阳性对照。阑尾包含的组织种类较多，如有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管、间皮等。因此，一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体。
1 、载玻片的处理： 抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下： 1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。 1.2 HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。 1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。 2 、常用酶消化： 2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。 2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。 2.3 皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~10g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。 3 、抗原热修复： 可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0 ± 0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。 ……………… 详细资料请参考：on http://www.bio1000.com/experiment/immunology/228697.html
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影响免疫组化染色质量的因素有很多，在实验中应注意组织的取材和固定，选择质量好的商品化抗体，恰当地选择和使用封闭和抗原修复手段，严格的技术操作和对照等。
1。假阴性反应可发生在：
1) 组织内待测抗原已被分解破坏，或抗原含量过低；
2) 抗原被遮盖，多由于醛类固定剂的使用，使组织中的大分子蛋白借醛键形成交联而遮盖待检抗原；
3) 抗体质量不佳或稀释度不当；
4) 技术操作失误等。
2．假阳性反应可发生在：
1) 抗体与非待检抗原发生交叉反应，在使用多克隆抗体时易出现；
2) 组织对抗体的非特异性吸附，特别是在有大片组织坏死或组织中有较多富于蛋白的液体时容易发生；
3) 内源性过氧化酶的作用，在脾脏、骨髓及一些炎性病变组织的染色中易出现；内源性碱性磷酸酶的作用，特别是肠黏膜上皮和肾近曲小管的刷状缘有高浓度的碱性磷酸酶，若处理不彻底，易出现假阳性结果；
4) 判断失误，将肿瘤组织中残留的正常组织的免疫组织化学阳性信号误认为是肿瘤的染色反应；
5) 当肿瘤浸润破坏正常组织时，使被破坏的正常细胞胞浆内的可溶性蛋白释放，后者被肿瘤细胞非特异吸附或吞噬，使瘤细胞出现该种抗原的阳性反应；⑥外源性和内源性色素的干扰。
免疫组化结果判读
1. 免疫组化结果的判读首先涉及确认实验操作的质量。合格的染色结果应当显示浅淡的背景色或无着色，同时阳性标志物需要清晰且定位准确。2. 在判断组织样本中是否存在阳性标记物时，应细致观察阳性信号的分布区域和形态特征。通常，阳性信号应与目标抗原的预期位置相符，这包括不同组织和细胞区域的分布。3. ...
免疫组化实验中DAB显色的原理?
DAB是过氧化物酶重要的显色底物之一，能被催化生成水不溶性的棕黄色产物，能直观地观察到，适用于各种斑点检测和免疫组化中的染色步骤。建议可以直接选用absin品牌的DAB试剂盒，试剂盒里的选色液都是配置好直接用的，可以根据实验需要选择不同的颜色 ...
免疫组织化学染色诊断是什么意思
只要是能够让抗体结合的物质，也就是具有抗原性的物质包括蛋白质、核酸、多糖、病原体等都可侦测。免疫组织化学的优势在于专一性、灵敏度、简便快速以及成本低廉，所以广为医院采用，通常是借由特定的肿瘤标记来筛选癌症。免疫组织化学染色法对基础研究及预防和诊疗上都是相当重要的一个方法。
免疫组化和免疫荧光的区别有哪些?它们相应的服务有哪些?
2.标本制作：免疫荧光一般用冰冻切片,减少杂质干扰;而酶免疫组化一般用石蜡切片或冰冻切片均可以。3.实验步骤:免疫荧光染色步骤简单,而酶免疫组化方法较为复杂,多了DAB显色过程。4.染色后的标本保存:免疫荧光染色后的标本一般短时间拍照,时间长了荧光衰退;而酶免疫组化染色标本可以长期保存。5.免疫...
免疫组化结果分析
免疫组化的主要目的是为了定位，确定与特定过程或功能的相关性。例如，如果免疫染色仅出现在某一特定细胞，那么就可以推测其与该细胞特定功能相关。如果免疫染色仅在组织或细胞的某一特定时期出现，那么就有可能与这一时期的特定作用有关。根据这些结果，我们可以设计进一步的实验，如抑制或促进其表达，以...
免疫组织化学染色诊断单独温控法是啥意思
而单独温控法是免疫组织化学染色中的一种特殊方法，它是在免疫组化实验中常用的一种温度控制方法。在单独温控法中，组织标本会被分别用不同的一抗和二抗进行染色反应，每次反应后会用高温或低温处理，以控制反应的特异性和灵敏性。这种方法可以避免一些非特异性反应的发生，提高染色的准确性和特异性。同...
免疫细胞化学技术的标本的制备
– 优点:操作简单、经济,适用于所有的实验室,– 缺点:对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。(3) 微波照射法· 将玻片放入装有抗原修复液的容器中,置微波炉加热至95℃以上,持续l0～15分钟,冷却后,按免疫组化染色步骤进行。· 此方法由于微波场内极性分子、离子高速运动,撞击交联的网链,使抗原异常的构想恢复正常,...
免疫组化实验原理(Vector kit)
加入一抗二抗，经DAB底物显色，用普通的显微镜观察信号分布和强度。专业一点，免疫组化包括免疫组织化学和免疫细胞化学，即IHC和ICC。ICC与IHC的区别在于样品的不同，ICC的样品是细胞（提前制作的细胞爬片），并且常用荧光染色检测，也可以用酶联抗体显色，最后分别用荧光显微镜和普通光学显微镜观察和拍照。...
下面这组免疫组化结果表示什么意思啊?
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。抗体 免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆...
免疫组化结果分析 MLH1(+)MSH2(+)MSH6(+)PMS2(部分+)是什么意思?_百度...
这是胃肠道癌术后的常规检测，是为了除外林奇综合征（Lynch Syndrome），林奇综合征是一种常染色体显性遗传疾病，基因突变后引起的结肠直肠癌、子宫内膜癌、胃癌的遗传易感性增高。检测基因包括MLH1, MSH2, MSH6等。如果结果阳性，提示在林奇综合征基因上存在致病突变，增加了多种癌症患癌风险，主要是结直...
孟种博迪： 免疫组化染色影响因素 影响免疫组化染色质量的因素有很多,在实验中应注意组织的取材和固定,选择质量好的商品化抗体,恰当地选择和使用封闭和抗原修复手段,严格的技术操作和对照等. 1.假阴性反应可发生在: 1) 组织内...
金门县19756226244： 免疫组化注意事项? - ？
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金门县19756226244： 抗原修复的作好免疫组化染色必须注意的问题 - ？
孟种博迪： I、为达到免疫组织化学技术的要求,组织固定越新鲜越好. 在免疫组化最后结果的判断时,常可见到均匀一片的似非特异性染色的现象,经多方研究认为,它是一种假性非特异性的染色.因为肿瘤组织中含有的抗原较易发生扩散弥散,肿瘤细...
金门县19756226244： 病理诊断工作中应用免疫组化技术应注意哪些问题? ？
孟种博迪： (1) 常规HE染色切片的光镜观察仍然是病理诊断的主要手 段:免疫组化技术仅是辅助手段之一,其他的辅助手段还有特殊 染色、电镜和其他新技术.它们的应用只有在光...
金门县19756226244： 巴氏染色的巴氏染色的操作方法及注意事项 - ？
孟种博迪： 染色有4个步骤:1、固定;2、核染色;3、胞浆染色;4、透明. 主要达到以下要求:1、核的结构清晰;2、透明度高;3、分色恰当. 固定的目的细胞制片的迅速固定是制片过程中关键的一步,否则会影响细胞学诊断的准确性.对于不同的标...
金门县19756226244： 免疫细胞化学染色时应注意哪些问题? - ？
孟种博迪： 注意时间啦,,这是决定染色好坏的关键,,也是最难掌握的,,其余染色剂的选择等应该不是大问题吧,,一般都按要求做,,
金门县19756226244： 细胞爬片免疫组化的注意事项是什么? - ？
孟种博迪： 【步骤】 1、 将已消毒的20mm盖玻片置于90mm培养皿中,按2*104/ml的细胞密度将细胞接种于培养皿中进行细胞爬片,5天后进行免疫细胞组织化学染色鉴定. 2 、PBS清洗标本 3次 各 1 min. 3 、冰丙酮固定 15 min. 4 、空气干燥 5min. ...
金门县19756226244： 如何正确地判断和分析免疫组化的结果? ？
孟种博迪： (1) 首先要确定免疫组化技术是否合格,合格的染色结果应 该是背景颜色浅淡或无着色,而阳性标志物清晰和定位明确.切 片中的正常组织可以作为最简便的对照来判断染...
金门县19756226244： 免疫组化检测一定要进行预实验设计吗? ？
孟种博迪： 在免疫组化实验中,每个实验室常选择不同的检测系统,技术操作方法亦不尽相同.因 此,获得一张满意的免疫组化切片也并非易事.设计一个成功的免疫组化预实验是免疫组化 检测的关键:①为保障实验结果的可靠性,应选择使用低交叉反应的抗体.②在使用新抗体 时,必须进行预实验测试抗体浓度.③一抗抗体的孵育条件、温度、洗液的pH都会影响染色 质量,要针对不同的抗体和样本进行优化.④选择合适的对照对解释检测结果的真实性是至 关重要的(包括阳性对照、阴性对照和空白对照).
