花青素的纯化方法
纵观保健食品的发展,大体可分为四个阶段。第一个阶段,保健食品的功效成份主要是中草药,如枸杞、当归、洋参等等;第二个阶段,保健品的功效成份主要是化学微量元素和化学合成制品,如补钙、补铁、补锌、维生素等等;第三个阶段,保健品的功效成份主要是动物直接提取物,如鲨鱼软骨素、羊胎素、深海鱼油等等;进入二十一世纪,随着基因工程、细胞工程、发酵工程等生物工程技术的发展,人们已可以将人体养生保健所必需的各种生物活性精华物质,根据不同人群的不同需求采用生物工程的方法分类生产,从而将保健食品的科技水平和使用功效提升到一个崭新的阶段,被誉为第四代生
体内含有片状和杯状叶绿体,一般无淀粉核。无性生殖时,产生不能游动的似亲孢子(autospore)。有性生殖尚未发现。
原花青素(简称PC)是植物界中广泛存在的一大类多酚类化合物。植物化学家通常将从植物中 分离得到的一切无色的,在无机酸存在和加热处理下能产生红色的花青素(cyanidin)的一类多酚化 合物统称为原花青素。从20世纪60年代初至今,原花青素抗氧化、清除自由基等一系列化学反应已 被初步揭示,这类天然产物在医药、食品、日用化 学品等领域的应用日益广阔。全世界对原花青素的研究越来越深入,其中对原花青素提取、分离、纯 化方法的研究是一大重点,现将原花青素提取、分 离、纯化方法综述如下。1 原花青素的提取方法
植物材料中原花青素的提取率与材料的状况和 提取条件密切相关。植物材料的贮存、干燥、粉碎 度,提取溶剂、温度等都可能导致原花青素化学结 构的变化和提取率的改变,从而改变原花青素的理化性质和生物活性.
当测定原材料中的原花青素含量时,贮存时间 越长,可能会导致测定结果降低。同时样品中的水 分含量也会导致测定结果降低。而且干燥条件的不 同也会导致提取率的变化,最好是采用冷冻干燥, 避免高温。
样品提取前一般要经过粉碎,通常较细的粉末 有利于提取,但过细时提取率反而会降低。
提取剂的选择也是影响提取率的关键因素。因 为原花青素在植物体内通常与蛋白质、多糖等以氢 键和疏水键形式形成稳定的分子复合物,原花青素 分子间也是如此。因此原花青素的提取剂,不仅要 求对其有很好的溶解性,而且还必须有氢键断裂作 用。因此有机溶剂和水的复合体系(有机溶剂占总 体积的50%~70%)最适合提取。有机溶剂的提 取能力顺序为丙醇<乙醇<甲醇<丙酮<四氢呋喃,其中应用较多的是丙酮一水体系和甲醇一水体 系。
当植物样品中铁等金属离子含量较大时,原花 青素在中性条件下与金属离子发生络合沉淀,沉积 在纤维中不利于提取。此时也必须采用酸化溶剂, 一方面断裂原花青素与蛋白质、多糖及本身离子间 的氢键和疏水键,另一方面断裂原花青素一金属离 子络合键,提高提取率。
1.1 传统有机溶剂提取
Ayroles等在1991年发明酮类化合物水溶液作 提取剂提取银杏叶中的原花青素的方法。采用酮类化合物的水溶液作提取剂,提取液过滤后,用碱调 节滤液pH值至9左右,使原花青素沉淀,再用酸 调节滤液至pH值为2左右,在(NH4) SO 存在条件下用c ~c 酮类萃取滤液中的原花青素,除去酮类 化合物,干燥。
Romanczyk等发明从可可中提取原花青素时, 对脱脂可可豆用质量分数70%MeOH/去离子水提 取后,再用质量分数70%丙酮/去离子水溶剂提取 2次,真空浓缩,除去有机溶剂后,再溶于水中, 用CHC1,提取,其水相用乙酸乙酯提取后,真空浓 缩除去乙酸乙酯,水相冷冻干燥,得到原花青素。
1.2 绿色溶剂—— 水提取技术
由于丙酮等有机溶剂可能带来环境污染和产品 的有毒有机物残留,人们在大力发展对环境友好的绿色提取技术。1998年Duncan和Gilmour发明一 种从植物材料(树皮、树叶、葡萄籽、皮、大豆、绿茶)中提取原花青素的方法。将材料粉碎(≤15 mm),常压、60℃~100℃或高压100℃~125℃条 件下采用脱氧热水提取(1 min~20 h),过滤采用超滤 或反渗透或两者连用,浓缩滤液,真空喷雾或冷冻 干燥,此法主要是提取分子量≤5 000 D的水溶性原花青素,得率为0.5%~10.0%之间,通常为6.5% 一9.6% (随取样部位的差异而定),分离得到原花 青素B 、B,、B 和c 。获得的产物对AAPH引发 的亚油酸的氧化有明显抑制作用,1肛g/mL能达 到70%~79%的抑制率。毒理学检测表明:对于按人体重剂量给药组和100倍人体重量的剂量给药组 24 h内无毒害和副作用产生,慢性毒理学(5个月) 实验也无明显毒、副作用。
1999年Karim等人发明了在加压条件下,采用 脱氧去离子水提取植物材料中的原花青素。将提取 液超滤后,采用疏水性微孔聚合物树脂作填料的柱 色谱方法,选用极性洗脱液(乙醇+水)洗脱,将 洗脱液采用反渗透方法除去乙醇,干燥得到原花青素。
1.3 超临界流体萃取技术
孙传经等发明一种采用超临界二氧化碳加丙酮 和水组成的极性改性剂,从银杏叶中萃取含有原花青素提取物的方法。在萃取温度60℃~90℃,萃取 压力20 MPa~35 MPa下加入丙酮与水的体积比为 (50%~80%):(50%~20%)的极性改性剂,萃 取时向2 h-4 h,进行静态、动态萃取。萃取液经传统的树脂浓缩和喷雾干燥器干燥,得到精制银杏叶 提取物。产品含银杏黄酮甙>35 g/100 g,萜内酯> 8 g/100 g,原花青素<7 g/100 g,酚酸<5 mg/kg。该法的优点是流程短,能萃取最强的天然抗氧化剂原花青素。2000年孙传经等又发明一种超临界CO 从黑加仑籽中提取黑加仑籽油和原花青素低聚物的方法。该法分两步进行:第一步,是利用超临界 CO 提取黑加仑籽油,控制萃取压力在25 MPa一 29 MPa,温度为60℃ ;第二步是超临界CO2加人 丙酮与水的体积比为70:30的改性剂,CO 与改性 剂流量体积比为4:1,压力为22 MPa~25 MPa,温度为60℃,提取原花青素低聚物。黑加仑籽油得 率为16%,原花青素低聚物得率为4%。该法优 点是同时获得两种产品,流程简单可靠,CO 和改 性剂循环利用,产品中无溶剂残留,对环境无污 染。
1.4 微波提取技术
刘征涛等发明了一种采用频率为2450 MHz或 915 MHz、功率为500 W~15 000 W 的微波对葡萄籽 在选用水、碳链长为C ~C,的醇、乙醚、丙酮、乙 酸乙酯、甲苯或其混合物的溶剂中进行处理,从葡 萄籽提取原花青素类物质的新方法。该方法较常规 化学法工艺简便、高效、快速,成本低,废液排放 量少。
1.5 双水相萃取方法
自1956年瑞典伦德大学的Albertsson发现双水 相体系到1979年德国GBF的Kula等人将双水相萃取分离技术应用于生物产品分离,虽然只有20多 年历史,但由于其条件温和,容易放大,目前已成 功地应用于蛋白质、核酸和病毒等生物产品的分离纯化。近几年来,有关双水相萃取技术提取中草药 有效成分的文献开始报道,尽管数量不多,但是已 有的实例充分表明其有良好的应用前景。用双水相萃取体系富集分离银杏叶浸提液的研究,表现良好 的分配系数和分离效果。研究认为双水相体系具有 分相快,使用温度低,易于操作等待点,且所使用的PEG及盐类对人体及环境无毒害,萃取率高,为 银杏黄酮化合物富集分离的一种有效方法。尽管双 水相萃取对中草药提取研究的应用处于起步阶段,这一技术的应用有望为从天然产物中提取有效成分 提供一个新的思路。
2 原花青素的纯化、分离
2.1 液相萃取法
原花青素的纯化多采用乙酸乙酯、甲苯、二氯 甲烷、醚等多级有机溶剂通过液相萃取的方法进行,这类方法因为有机溶剂用量大,对环境可能带 来污染,同时也容易造成产品中有毒有机物残留。
2-2 柱层析法
目前常采用的纯化方法多用柱层析法进行。王 建清等对大麦中的原花青素丙酮提取液,采用 PVPP树脂作柱层析的填料,以CH CN作流动相进 行纯化。
Ricardo da silva等将葡萄用甲醇提取,提取液 回收甲醇后,通过聚酰胺柱进行初步分离,先用中 性水洗去酚酸,再用体积比30:70的乙腈/水洗脱 儿茶素,再用体积比75:25丙酮水洗脱原花青素, 进行纯化。
刘睿等采用大孔树脂对高粱中的原花青素用乙醇 的水溶液进行纯化,得到产物纯度大于95 g/100 g的 低聚体原花青素。
2.3 固相萃取法
从复杂体系中选择性地萃取所需成分,固相萃 取(SPE)是其中最为有效的方法之一。1999年 Lazarus等人对杏仁皮、葡萄汁和红葡萄酒中的原花 青素采用SPE方法进行纯化,条件:supelcosil Envi一18 20mL SPE柱,流动相:丙酮:水:乙酸= 70:29.5:0.5 (体积比)。Kennedy和Waterhouse 对红葡萄酒中的原花青素采用c一18柱(Alhech), 流动相:水和甲醇。洗脱除去有机酸、糖类和其他 不溶于有机相中的化合物而将提取得到的原花青素 进行纯化。
2,4 凝胶色谱法
凝胶色谱也常用于原花青素的纯化。 SephadexLH一20是一种对黄酮类化合物具有高度亲 和性的羟丙基化葡聚糖凝胶,Sephadex LH一20凝 胶色谱目前多用于原花青素的纯化和分离。但 Sephadex LH一20凝胶的物理特性决定其并不能对原花青素进行高效率分离。所以进一步的纯化和分离 要采用凝胶过滤色谱或HPLC进行。
此外,Sepherdex 75HR作为平均粒度为13 m 的葡聚糖聚合物,也用于原花青素的纯化、分离, 其能承受超过1.8 MPa的反压,尽管这种材料的商业 柱通常用于蛋白质的分离,发现其分离原花青素的 能力优于Sephadex LH一20。McMurrough和Madigan 将大麦提取液浓缩后,直接采用高效凝胶过滤色谱 (Sepherdex 75HR),用甲醇洗脱,根据uV检测, 收集洗脱物,用DMACA鉴定每个组分。Escribano— Bail 6 n et al采用Sephadex LH一20和半制备RP—HPLC对葡萄籽中的原花青素进行纯化。
Rigaud等对可可和葡萄籽的提取物,采用凝胶 渗透色谱(GPC)TSK G 2500 Hxl和TSK G3000 Hxl, 采用四氢呋喃(流速1 mL/min)洗脱进行纯化。
2.5 微生物发酵法
Ariga等发明一种由活性酵母,可将用水和有 机溶剂提取得到的提取物中的淀粉发酵除去而达到 纯化原花青素的目的;同时还发现纯化的原花青素 中金属离子也能较好的被除去,如果提取剂是水和 水/乙醇,能直接浓缩后发酵,若提取剂是丙酮, 则要除去丙酮后才能进行发酵。常用的酵母有:葡 萄酒酵母、酵母属和接枝酵母属的菌株。
2.6 高速逆流色谱法
高速逆流色谱技术由美国国家医学院Ito Yiochiro 博士20世纪60年代首创,最初是一种制备型色谱技术,是一种不用固体载体或支撑体的液液分配色 谱,主要根据化合物在不相溶的两相间的分配能力 进行分离,具有分离效率高,产品纯度高,不存在载体对样品的吸附和污染,制备量大,溶剂消耗 少,而且操作条件简单(室温、Teflon惰性柱材) 的特点。目前已被广泛用于天然药物材料的制备和分析。
目前高速逆流色谱仪已成功开发出分析型和制 备型两大系列。即高速逆流色谱仪既可用于天然药 物成分的制备分离,又可定量。进样量从几毫克到克,进样体积从几毫升到几十毫升,不但适于非极 性化合物的分离,也适用于极性化合物的分离,既 适合于天然产物功效成分的粗分,也可进一步精制、纯化。
2-7 分子烙印技术
分子烙印技术(molecular imprinting technology, MIT)是20世纪末出现的一种高选择性分离技术,由于MIT模仿了生物界的锁匙作用原理,使制备的 材料具有极高的选择性,因而很快在许多相关领域 如手性分离和底物选择性分离、固相萃取、化学或生物传感器、不对称催化和模拟酶等方面得到了应 用。在普通分离方面,较之传统方法,MIT法具有 高效、快速、专一的优点。MIT法在手性分离方面的作用更是无与伦比。据统计,现有药物60%具 有一个或一个以上的手性中心,而对映体间的药效 及对人体影响有很大不同,因此1992年美国食品和药物管理局规定,今后含不对称中心的药物必须 将光学异构体分离开。相对于传统方法的一筹莫展,MIT法就显得非常珍贵了。P>
周力等人在2002年制备了以槲皮素为模板的 分子烙印聚合物(MIP),从沙棘粗提物中分离提取槲皮素和异鼠李素两种黄酮,得到良好的分离效果。 谢建春等用非共价法,在极性溶剂中、以丙烯酰胺 作功能单体,以强极性化合物槲皮素为模板,制备了分子烙印聚合物(MIP)。液相色谱实验表明,MIP 对懈皮素具有特异的亲合性,将此MIP直接分离银杏叶提取物水解液,得到主要含模板槲皮素及与槲 皮素结构相似化合物山奈酚两种黄酮的组分。研究 证实了MIP技术用于直接分离、提取中草药中具有特定药效化合物的可行性。
微波提取技术
一种采用频率为2450 MHz或 915 MHz、功率为500 W~15 000 W 的微波对葡萄籽 在选用水、碳链长为C ~C,的醇、乙醚、丙酮、乙 酸乙酯、甲苯或其混合物的溶剂中进行处理,从葡 萄籽提取原花青素类物质的新方法。该方法较常规 化学法工艺简便、高效、快速,成本低,废液排放 量少。
花青素是一种水溶性色素,可以随着细胞液的酸碱改变颜色。细胞液呈酸性则偏红,细胞液呈碱性则偏蓝。花青素(anthocyanidin)是构成花瓣和果实颜色的主要色素之一。花青素为植物二级代谢产物,在生理上扮演重要的角色。花瓣和果实的颜色可吸引动物进行授粉和种子传播 (Stintzing and Carle, 2004)。常见于花、果实的组织中及茎叶的表皮细胞与下表皮层。部分果实以颜色深浅决定果实市场价格。
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