苹果中PPO 的动力学研究
作者&投稿：展心 （若有异议请与网页底部的电邮联系）
酶反应动力学主要研究酶催化的反应速度以及影响反应速度的各种因素.在探讨各种因素对酶促反应速度的影响时,通常测定其初始速度来代表酶促反应速度,即底物转化量>k+2时,Km=k-1/k+1=Ks.因此,Km可以反映酶与底物亲和力的大小,即Km值越小,则酶与底物的亲和力越大；反之,则越小.③Km可用于判断反应级数：当[S]100Km时,ν=Vmax,反应为零级反应,即反应速度与底物浓度无关；当0.01Km
主要研究化学反应机理和速率
源于澳洲青苹果的多酚氧化酶（PPO）特性及阻氧抑制技术研究
摘 要
澳洲青苹是一种优质高酸苹果，高酸度苹果汁生产的最佳原料。但在苹果汁生产中，鲜果经过破碎、压榨后，很容易发生酶促褐变，对产品的感官品质、风味和营养价值造成极大的影响，这也是阻碍我国果汁产业发展的一个重要原因。酶促褐变是在有氧条件下,多酚氧化酶氧化组织中内源性酚类物质形成邻醌，邻醌再相互聚合或与蛋白质、氨基酸等作用生成高分子络合物而使组织发生褐变的复杂生理过程。本试验成功的从澳洲青苹中分离纯化出多酚氧化酶，并对源于澳洲青苹的多酚氧化酶酶学特性进行了系统试验，建立了源于澳洲青苹的酶促反应动力学模型曲线，运用N2、CO2填充阻隔氧气来抑制多酚氧化酶的催化反应，从而有效地控制了酶促褐变的发生。
主要研究结果如下：
（1）采用丙酮粉沉淀抽滤法从澳洲青苹中提取多酚氧化酶。提取的粗酶液经30%～90%饱和度硫酸铵分级沉淀、透析除盐、交联葡聚糖G-75 凝胶色谱层析、后经PEG 6000浓缩，得到纯化的多酚氧化酶，纯化倍数为7.49。
（2）提取纯化所得的酶液经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,采用考马斯亮蓝R-250染色显示一条电泳带。其分子量介于31.0kD和43.0kD之间。
（3）通过对澳洲青苹多酚氧化酶与邻苯二酚反应产物的重复波谱扫描，方便快速的确定了量化反应产物含量的特定吸收波长λ＝410nm。
（4）澳洲青苹PPO酶学特性研究表明，PPO的最适pH值约为5.0，最适反应温度为16℃，热处理遵循一级动力；PPO对底物专一性高低的趋势为:邻苯二酚为最高，其次为绿原酸，焦性没食子酸，DL-多巴，对L-酪氨酸的活性为零，说明澳洲青苹PPO没有单元酚氧化酶活性。抑制剂对PPO活性有一定效果，其中，亚硫酸氢钠对PPO活性具有强烈的抑制作用，EDTA、抗坏血酸对PPO的抑制相对较弱。
（5）三氯乙酸是澳洲青苹PPO酶促反应有效的终止剂。降低氧气浓度可以抑制多酚氧化酶的活性，其中，4％的氧气浓度可完全抑制多酚氧化酶的活性；N2、CO2都能通过降低反应体系中氧气浓度而达到抑制多酚氧化酶活性的目的。
（6）澳洲青苹的可溶性固形物为(13.65±0.128)%，可滴定酸为(0.655±0.006)%，Vc含量为(87.67±0.220)mg/kg,具有很好的加工品质。气调破碎，通过用N2、CO2置换气体降低破碎环境中的氧气浓度能很好的减少苹果汁褐变程度。
关键词：澳洲青苹；多酚氧化酶；分离纯化；阻氧抑制
STUDIES ON THE CHARACTERISTECS AND THE INHIBITION BY BLOCKING OXYGEN OF PPO FROM GRANNY SMITH
ABSTRACT
Granny Smith is a kind of high quality apple with high acidity, which is suitable to produce the popular juice on international market. In the process of apple juice production, the fresh fruit is easy to occur enzymatic browning, which not only greatly influences the sensory quality, the flavour and nutritional value of the product but also is an important reason for blocking the development of our fruit juice industry. This browning is usually due to the catalytic action of the enzyme polyphenoloxidase(PPO).o-Diphenols, present in the tissue of fruits and vegetables, are oxidized by polyphenoloxidase in the presence of oxygen. This oxidation reaction results in the production of o-quinones, which subsequently polymerize with other o-quinones, phenolic substances, proteins, amino acids, etc. to produce brown pigments. These pigments are sometimes referred to as melanins. In this experiment, PPO was Purified from Granny Smith ,and its common enzyme properties were studied. The activity of PPO was inhibited by reducing oxygen concentration. The study shows that blocking oxygen is the effective method to control enzymatic browning. The results are summarized as follows:
(1) PPO was extracted from Granny Smith with acetone. The crude enzyme extract was fractionated with solid ammonium sulfate of 30%-90% saturation. After dialysis, the enzyme solution was purified by sephadex G-75 column chromatography respectively. The enzyme was concentrated by PEG 6000.A7.49 fold purification of PPO was obtained.
(2) The result from polyacrylamide gel electrophoresis of purified enzyme indicated that only one band was found using coomassie brilliant blue R-250 stain, and their molecular weight were 31.0kD～43.0kD.
(3) The largest absorbion of the product of the reaction between PPO and catechol was at λ=410nm.
(4) pH optimum was 5.0 with catechol, and temperature optimum was 16℃. The enzyme had different substrate specifities for dirrerent phenolic compounds, a maxium activity was showen with catechol, followed by chlorogenic acid, pyrogallol, DL-DOPA. The activity with tyrosine was not detected. Sodium bisulfite is the best inhibitor.
(5) Trichloroacetic acid is a kind of short-stopper which can stop enzymatic reaction. when the oxygen concentration was decreased to 4%,the activity of PPO was inhibited clearly.
(6) Granny Smith is one of the most suitable breeds for making concentrated apple juice. The results showed that the content of soluble is (13.65±0.128)%, the organic acid is(0.655±0.006)%, and Vc is (87.67±0.220)mg/kg. Atmosphere crushing can control the enzymatic browning of apple juice.
Key words: Granny Smith, polyphenol oxidase, purification，inhibiting by blocking oxygen
苹果梨多酚氧化酶仅作用于邻苯酚，与对苯酚、间苯酚和一元酚无作用。以儿茶酚为底物，该酶的最适pH为6.5，在30℃下活性最强。除氯化钠和蔗糖外，供试的其它7种抑制剂均可不同程度地对该酶产生抑制，其中以焦亚硫酸钾效果最好。
不该大川： Polyphenol oxidase is caused enzymatic browning of fruits and vegetables major enzymes, cause browning of fruit juice most important factor. PPO sources are different, their physical and chemical properties are fairly different. thus on the same ...
金东区17110987148： 苹果为什么会氧化 - ？
不该大川： 苹果切口氧化变颜色的现象叫做酶促褐变 主要是苹果中的多酚氧化酶(PPO)把酚类底物氧化为醌类,醌聚合成为褐色素而引起组织褐变 影响酶促褐变的方法有很多,但途径主要是以下四条:1、钝化酚酶的活性(调节温度、抑制剂等.2、改...
金东区17110987148： 多酚氧化酶的制备和性质的研究 自己设计实验怎么做啊 各位大侠拜托了 马上就要要 . - ？
不该大川： 多酚氧化酶的制备 1.称取150g马铃薯,切块后放入匀浆机,加入150mLNaF溶液,匀浆后用四层纱布过滤; 2.量取50mL滤液置离心管中,于3500转/min离心5~10min; 3.取上清夜,加入固体硫酸铵16g,溶解,于4℃放置30min; 4.于3500转/min离心15min,倒掉上清液; 5.沉淀用15mL pH6.8的磷酸盐缓冲液溶解,得含有马铃薯多酚氧化酶得粗酶液.
金东区17110987148： 苹果水煮变色原因 - ？
不该大川： 通过在不同温度和时间下热处理苹果汁,研究了使果汁中多酚氧化酶(PPO)部分或完全失活的条件,并考察了与果汁自然pH值相近的模拟体系对处理后的果汁酶活的抑制情况.表明:75℃、30s虽不能完全灭活PPO,但对其活性破坏较大,处理后的PPO酶活可以较好地被接近果汁自身pH值的低pH(3.8)所抑制,为最佳处理条件.
金东区17110987148： 果蔬中PPO多酚氧化酶酶活的测定方法？
不该大川： 薄层色谱(TLC)和高效液相色谱(HPLC)法鉴定
金东区17110987148： 苹果为什么放在盐水里不会变色 - ？
不该大川： 因为制造出了苹果组织与空气相隔离的隔离膜,更重要的是,抑制了氧元素在苹果细胞中的扩散.阻止了氧元素,便使其不能与PPO、植物细胞内含有的铁元素相接触了. 用刀切开的瞬间,水果和蔬菜的自我破坏便开始了.其触感和颜色开始...
金东区17110987148： 为什么苹果掉在地上后会立刻变淤? - ？
不该大川： 每种细胞都含有成千上万种酶.这些酶参与了细胞自身生存所必需的全部反应.导致苹果变淤的实际机理涉及一种叫做多酚氧化酶(又名酪氨酸酶)的酶.……褐化反应是由一种在常见的植物组织中常见的多酚氧化酶 (PPO)作用下,水果中的酚类化合物所氧化导致的. 只要您切开任何水果,一些细胞就会被割破.然后酶会接触到空气中的氧气并发挥作用让水果变成褐色.变淤. 防止褐化最简便的方法是将切好的苹果放入水中,这样酶就不会接触到氧气了.您还可以对苹果进行加热从而让酶变性.在人体中,酪氨酸酶也是非常重要的,因为它有助于黑色素的生成,而黑色素致使肤色变黑.人体中缺乏酪氨酸酶会导致白化病.所以在人体中,由酪氨酸酶辅助引起的肤色褐化实际上是件好事!
金东区17110987148： 果蔬中多酚氧化酶(PPO)含量到底是高好还是低好? - ？
不该大川： 为了防止果蔬氧化,减缓氧化的速度,PPO含量越低,氧化反应进行得越慢,氧化酶促进氧化反应的进行的. 酶促褐变是在有氧条件下,由于多酚氧化酶(PPO,EC1.10.3.1)的作用,邻位的酚氧化为醌,醌很快聚合成为褐色素而引起组织褐变.PPO是发生酶促褐变的主要酶,存在于大多数果蔬中.在大多数情况下,由于 PPO 的作用,不仅有损于果蔬感观,影响产品运销,还会导致风味和品质下降,特别是在热带鲜果中,酶促褐变导致的直接经济损失达50%.
金东区17110987148： 土豆切开为什么慢慢变红? - ？
不该大川： 削皮后的土豆发生酶的褐变导致颜色变深. 植物细胞中的酚类物质便在酚酶的作用下,与空气中的氧化合,产生大量的醌类物质. 褐变的发生主要有三个条件:多酚勒物质,多酚氧化酶和氧. 土豆削皮后暴露在空气中,其中的多酚类物质和氧...
金东区17110987148： 有什么方法可以保护苹果汁的氧化吗? - ？
不该大川： 要使苹果汁不氧化,可在制作这款果汁的时候加入一些盐水或柠檬汁,也可以将切好的苹果浸在水中或在苹果切面上涂满糖浆、蜂蜜. 阻止苹果变色的方法有两个:一个是除去酵素,另一个是除去氧气.在食用前,将切好的苹果浸在装满水的容...
