实验专栏 | 大肠杆菌原核表达的整体思路
作者&投稿：西剂 （若有异议请与网页底部的电邮联系）
在探索生命现象的过程中，蛋白质的结构与功能成为了现代生物学研究的核心。为了深入理解生命过程，研究蛋白质的表达与功能成为了生物学家们的重要任务。而大肠杆菌原核表达系统因其操作简单、成本低廉且表达量高，成为了蛋白质表达领域的首选方法。下面，我们将对大肠杆菌原核表达的整体思路进行简要介绍。
原核表达的整体思路主要包括以下几个步骤：
第一步：确定表达策略
在进行表达之前，首要任务是确定合适的表达策略。这涉及到三个关键方面：目的基因来源、载体选择以及菌株选择。
首先，目的基因的来源决定了后续步骤的执行。基因可以从NCBI数据库中获得，随后需要对基因序列和来源物种进行分析，以便了解其密码子偏好性和蛋白质的定位。然后，根据基因的性质选择合适的载体，如pET系列、pMAL系列或pGEX系列等，这些载体各有特点，适合不同类型的蛋白质表达。此外，还需要考虑载体的表达调控元件、拷贝数以及是否带有易于纯化的标签，如6His、MBP等。
第二步：获得目的基因
目的基因来源物种的获取方式多种多样。如果物种容易获得，可以提取基因组或总RNA进行PCR或RT-PCR扩增。当物种难以获取时，可以通过优化目的基因序列后进行合成。
具体而言，通过PCR方法，使用含目的基因的克隆质粒作为模板，设计一对引物，分别包含不同的酶切位点，以实现基因片段的扩增。而通过RT-PCR方法，首先从细胞或组织中提取总RNA，通过逆转录形成cDNA第一链，然后以此为模板进行PCR循环。
第三步：构建重组表达载体
构建载体通常采用酶切/酶连的方法。现在市场上有很多公司提供了重组试剂盒，使得构建载体变得更为简便且成本逐渐降低。构建载体的基本流程包括载体酶切、PCR产物的双酶切回收、连接入载体以及后续的转化、筛选和测序。
首先，载体需用限制性内切酶进行双酶切，随后通过琼脂糖电泳进行回收。接着，将PCR产物进行双酶切回收，再在T4-DNA连接酶的作用下连接入载体。完成连接后，下一步是进行转化、筛选和测序，以确保构建的载体正确无误。
第四步：转化表达菌株与小量表达
通过测序验证后，将构建的载体转入表达菌株中。接着，挑取几个单克隆进行小量表达，通过SDS-PAGE或Western Blot方法分析表达情况。在此基础上，优化表达条件，包括诱导时机、诱导剂的量、诱导时间以及培养温度等，以获得最佳的表达效果。
如果实验出现不表达的情况，需仔细分析问题所在，如蛋白毒性或本底表达等，并相应调整表达策略。
第五步：大量表达
经过小量表达的优化后，根据所需蛋白量，按照优化的条件进行大量表达。确保实验的重复性，严格进行放大操作。收集菌体后，使用预冷的PBS清洗，若不立即纯化，建议进行液氮冷冻后保存于-80℃。
在整个过程中，大肠杆菌原核表达系统为蛋白质表达提供了便利，但实际操作中仍需细心关注每个环节，确保实验的顺利进行。希望本文能够为研究者们提供有益的参考和指导。
东方陶勃名： 说起来容易做起来就要摸索了,基本步骤:目的基因的扩增→载体与目的基因双酶切→电泳→割胶回收→目的基因与载体的连接反应→重组体筛选→验证重组体→转化入大肠杆菌进行表达.问题在于:目的基因如何获取,扩增策略的决定,表达载体的选择,双酶切选择哪一对限制性内切酶,如何筛选重组体等等.
成安县17653104101： 以大肠杆菌为例,详细阐述原核生物的转录过程 - ？
东方陶勃名： 乳糖(lac)操纵子由调节基因,启动基因、操纵基因和三个结构基因lacZ、lacY、lacA组成. 调节基因lacI组成型表达,编码阻遏蛋白,既有与操纵基因lacO结合的位点,也有与诱导物结合的位点.当诱导物与阻遏蛋白结合时,可改变阻遏蛋白...
成安县17653104101： DNA,纯化,表达,连接. - ？
东方陶勃名： DNA 纯化 在生物技术实验中,我们粗提取的DNA需分离纯化去处蛋白质等杂质,我们都需要将最终的结果在琼脂糖凝胶, 或PAGE凝胶上走电泳观察,以判断我们实验的正确性以及DNA片段的完整性.同时通过紫外分光光度计测定OD260,OD...
成安县17653104101： 8、pET系列的原核表达载体中外源基因在大肠杆菌中诱导表达的原理? ？
东方陶勃名： 因为大肠杆菌是原核生物,没有内质网来修饰合成的胰岛素前体,使其表现活性,所以不能使得胰岛素的基因正常表达.就是说,真核基因在原核生物体内时很少能够表达的,特别是需要内质网等修饰的蛋白质的基因.
成安县17653104101： 用原核载体克隆并表达一种生物中的某个基因(序列已知),这种生物若是一种原核生物,应如何设计实验? - ？
东方陶勃名： 原核表达是目前最常用的表达系统,一般在大肠杆菌中做,也有在酵母,乳酸菌或者真核细胞里面做.大肠杆菌是工程菌,易操作,不会存在质粒转不进去的情况.因为酵母,乳酸菌等细胞内部一般都存在限制修饰系统,不是所有的工程质粒都...
成安县17653104101： 原核蛋白表达的优缺点有哪些 ？
东方陶勃名： 大肠杆菌是当前采用最多的原核表达体系,运用大肠杆菌表达载体符合下述标准:①含大肠杆菌适宜的选择标志②具有能调控转录、产生大量mRNA的强启动子③含适当的翻译控制序列和翻译起始点等④含有合理设计的多接头克隆位点,以确保目的基因按一定方向与载体正确衔接表达产物的分离、纯化. 大肠杆菌表达体系中尚有一些不足之处:①由于缺乏转录后加工机制,只能表达克隆的cDNA,不宜表达真核基因组DNA②由于缺乏适当的翻译后加工机制,表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或进行糖基化修饰③表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体,欲使其具有活性尚需进行复杂的复性处理④很难表达大量的可溶性蛋白. 如果你在这方面不是很有经验,可以找纽普生物帮忙做.
成安县17653104101： 真核基因在原核细胞中如何表达 - ？
东方陶勃名： 基因工程操作的过程中,在导入真核细胞的目的基因时一般用人工合成基因的方法.即以目的基因转录成的信使RNA为模板,反转录成互补的单链DNA,然后在酶的作用下根据碱基互补原则合成双链DNA,从而获得所需要的目的基因.或根据...
成安县17653104101： 关于原核表达基因测序问题 - ？
东方陶勃名： 其实简单一点,可以直接克隆到表达载体上,送去测序确定之后再表达;我们以前一直这么做的;但是有些情况下,比如表达载体不是诱导型的,或者表达的蛋白对大肠杆菌宿主菌毒性很大,影响菌的生长,导致菌生长困难、提质粒困难等等,就会先克隆到一个克隆载体上面,做测序确定;然后再克隆到表达载体上.通常来说我不太喜欢做两次克隆,总是酶切转化筛选;我喜欢选控制比较严谨的可调控性原核表达载体,比如pET系列的多个载体,直接把目的基因克隆上去.
成安县17653104101： 大肠杆菌表达动物基因有什么困难?要怎么解决? - ？
东方陶勃名： 大肠杆菌是原核生物,基因中没有内含子. 动物是真核生物,基因中有内含子.要让动物的基因在大肠杆菌中表达,要先把内含子去掉.一般是让mRNA逆转录形成cDNA,然后再用载体将cDNA转导到大肠杆菌中.
成安县17653104101： 质粒pET的p的含义是什么,ET的含义是什么. - ？
东方陶勃名： p—plasmid(质粒),一般质粒载体前面都要加一个p E—E. coli (大肠埃希氏菌,通常称为大肠杆菌),为了表明这个载体是用于原核表达的. T—在这里代表T7启动子,该载体含有一个不为大肠杆菌RNA 聚合酶识别的T7 启动子用于诱导表达目的蛋白.
