活性氧检测流式细胞仪结果怎么处理
活性氧检测试剂盒（Reactive oxygen species assay kit）是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。 本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup以便于活性氧的检测。Rosup是一种混合物（compound mixture），浓度为50mg/ml。
一、注意事项
1、探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
2、探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。
3、尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。
4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
二、使用说明
1、装载探针
对于刺激时间较短（通常为2小时以内）的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激
时间较长（通常为6小时以上）的细胞，先用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。
原位装载探针：本方法仅适用于贴壁培养细胞。按照1：1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA的体积为1毫升。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
收集细胞后装载探针：按照1：1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为一百万至二千万/毫升，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。直接用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞，或把细胞等分成若干份后刺激细胞。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
2.、检测
对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。
对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。
3、参数设置
使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。
4、其它说明
阳性对照可以按照1：1000的比例使用。例如装载好探针的细胞共1毫升，可以加入1微升的阳性对照刺激。通常刺激后20-30分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照的浓度。
另外，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1：2000-1：5000稀释DCFH-DA，使装载探针时DCFH-DA的浓度为2-5微摩尔/升。探针装载的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整。
大部分细胞是有本底荧光的，所以在加探针前要把阴性细胞的荧光值设为阴性。也就是认为的设一个阈值而已。
这类实验一般都是使用荧光探针来检测细胞内的活性氧的浓度，特异性比较低。结果是比较实验组和对照组的荧光强度，理论上，荧光强度和活性氧的浓度是正相关的关系。如何在流式细胞仪软件Winmdi显示凋亡百分比
我的问题刚好是如何去掉这个百分比 请问这位战友 你的问题解决了么？
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窦玛优氟： 流式检测ROS的特异性比较差.一般来说,针对过氧化氢和超氧化物有荧光探针.加到细胞培养液后,细胞摄龋遇到ROS,可以发出荧光,上机检测可以比较各组之间荧光强度的变化从而代表ROS水平的不同.
治多县13493828093： 流式细胞仪活性氧试剂盒阴性对照荧光强度大概多少 - ？
窦玛优氟： 阴性对照就是不放荧光探针的那个样本,一般通过调节PMT的电压把信号强度控制在0到10的三次方之间
治多县13493828093： 影响流式细胞术实验结果的主要因数有哪些 - ？
窦玛优氟： 1、样品处理,去除杂细胞、碎片等对正常细胞的计数;2、对照:设立负对照、同型对照、弱阳性对照,帮助你正确判断阴阳的界定;3、正确的补偿;4、正确的染色方法,抗体的比例...
治多县13493828093： 【求助】流式细胞仪检测细胞凋亡结果该怎样分析 - ？
窦玛优氟： 已经做完流式,看到结果却不知该怎样分析了.我用的是AnnexinV-FITC 凋亡试剂盒 ,AnnexinV/PI双染检测细胞凋亡.请教各位,凋亡散点图中第1,2,4象限到底分别代表什么细胞?手里的资料说法都不相同.试剂盒说明书:1代表细胞收集过...
治多县13493828093： 活性氧ROS,我已经买了它的试剂盒,其中有一个步骤是去除没有进入细胞的DCFH - DA,我做的是脑组织匀浆, - ？
窦玛优氟： 如果是做流式细胞仪的话,细胞悬液要洗一遍.离心后,重新悬浮细胞就好了.如果是细胞匀浆,就没有这一步.
治多县13493828093： 用流式细胞仪测细胞周期怎么处理样品 - ？
窦玛优氟： 根据你所购买的试剂盒而定,一般是先用70%乙醇先固定,然后加RNA酶和PI,半个小时左右上机检测就可以了.需要注意的就是加酒精固定的时候要用四度预冷的酒精,缓慢的加,边加边晃动细胞,避免细胞黏连在一起. (1)细胞培养 取对数...
治多县13493828093： 流式DCF MFI是什么意思 - ？
窦玛优氟： 您说的DCF应该指的是测量细胞内活性氧ROS含量的一个检测试剂,2',7' –dichlorodihydrofluorescein. CM-H2DCFDA在细胞内水解成DCFH,DCFH被胞内的氧化剂氧化成高荧光强度的DCF,用于检测ROS 的生成.通过流式细胞仪测定细胞内DCF的荧光强度,即可对单个细胞为基础的细胞内ROS进行原位实时检测,根据DCF荧光强度直接反映细胞内自由基的变化程度. 而MFI就是平均荧光强度(Mean fluorescence intensity),用于表示某个指标的流式检测最终的荧光强度,可根据MFI值的大小,表示本问题中DCF的含量,即ROS的水平.
治多县13493828093： 流式细胞仪检测结果问题 - ？
窦玛优氟： 1. 是100个细胞中表达CD33的细胞占80% 2. CD33 是粒细胞表面标志;CD19是B细胞表面标志.没有阳性阴性一说.主要是看是否是克隆增殖(癌变) 3.见异常细胞是诊断标准, CD33达80%,提示是粒系来源,有可能是粒细胞性白血病.骨髓瘤都是淋巴细胞来源的. 4.单凭流式不能诊断,还要有形态学(见到异常细胞).流式用来分类,定型.
治多县13493828093： 流式细胞仪测定细胞活性氧中阴性细胞(未加探针的)为什么有荧光?谢谢. - ？
窦玛优氟： 大部分细胞是有本底荧光的,所以在加探针前要把阴性细胞的荧光值设为阴性.也就是认为的设一个阈值而已.
