芋螺毒素的毒素制备

芋螺毒素的毒理学~

20世纪60年代在澳大利亚首次发现芋螺猎食鱼类。研究证实不同芋螺毒具有不同的生物活性组分。1997年从芋螺毒中纯化一个活性肽，并成功测定了其氨基酸组成，这个肽就是μ-芋螺毒素。第一个被弄清氨基酸序列并被化学合成验证了的芋螺毒活性肽是α-芋螺毒素GI，它是从地纹芋螺（Conus geographus）毒中纯化出来的，含2个二硫键，由13个氨基酸残基组成，是一种烟碱能型强拮抗剂，其作用类似于蛇毒神经毒素（如α-bungarotoxin，Cobratoxin）。紧接着从地纹芋螺毒中分离鉴定出另一种活性肽，是钠通道的阻断剂，其作用类似于Tetrodotoxin和Saxitoxin，它可引起哺乳动物麻痹反应。这两种肽是引起采螺人死亡的主要原因。 通过观察了对小鼠和金鱼注射contryphan-R后的行为学表现发现，对金鱼肌肉注射后，金鱼很快出现震颤、麻痹等症状。对小鼠颅腔注射时，低剂量（0.5～6.0nmol/g）可产生骚抓、舔咬、竖尾、桶状翻滚症状等；高剂量（8～20nmol/g）则会表现出抽搐、惊厥、瘫痪乃至死亡。产生这些行为学异常的具体机制尚不清楚。芋螺毒素特异性地作用于多种离子通道与神经受体，对鱼的毒性多在1~10μg/Kg之间。 20世纪80年代初，美国犹它大学的研究人员直接将芋螺毒组分注射到哺乳动物中枢神经系统，而抛开当时该实验室乃至大多数实验室已长期惯用的所谓的标准方法即腹腔内膜注射法(i.p.)，结果显示，用颅腔注射法引发了大量的小白鼠不同的行为症状反应，这揭示了芋螺毒的药理多样性；而用i.p法，只有很小比例的小白鼠产生稳定可测的症状反应。为了进行针对性研究而从这些症状反应中选择了一种“似睡”现象，把从芋螺毒中分离出的控制这种“似睡”现象的活性组分命名为“睡虫”肽(sleeper)，它能使年龄不到14天大的小白鼠进入“似睡”状态。而如果将这种“睡虫”肽注射到年龄为21天大的小白鼠颅腔，小白鼠却表现出超活跃症状反应，即小白鼠不停地在笼子四周边缘攀爬且从一角落跑到另一个角落。正因这种肽能诱发不同年龄大小的小白鼠表现出不同的症状反应，所以人们又将其称为“睡虫或爬虫”(sleeper or cleeper)肽。还有人从芋螺毒中纯化了“摇荡”肽(shaker)，该肽引发小白鼠颤抖。 逐渐减少睡眠肽的C端氨基酸残基后其活性逐渐下降，保持其活性存在的最短肽段为Con-T。而减少Con-R的C端氨基酸残基数目，其活性下降不是十分明显，Con-R尚且能够保持原始肽段活性不变，但是从Con-R开始，活性便逐渐下降，保持Con-R活性存在的最短肽段为Con-R。Con-G活性受C端氨基酸残基数目影响较大，Con-G活性逐渐降低，保持Con-G活性存在的最短肽段为Con-G。Blandl等发现，Con-R诱导小鼠睡眠持续时间为2~4 h，小于Con-R引发的6~8 h睡眠时间。由于放射性配体结合实验显示两肽段的活性相同，因此推断是由于Con-R分子C端的二硫键结构导致其体内半衰期延长，进而延长了小鼠睡眠持续时间。 从幻芋螺(C.magus)毒中纯化的“摇荡”肽(shaker peptide)和从地纹芋螺(C.geographus)毒中发现的另一个“摇荡”肽都能抑制青蛙神经肌肉连接处的钙流和突触传递。这表明“摇荡”肽可能作用于控制神经递质释放的一种新型钙通道。采用电生理技术分析鉴定新钙流研究“摇荡”肽影响钙通道及钙流，结果发现了一种新型钙导，即N-型钙流，这些“摇荡”肽专一地强有力地抑制N-型钙流。这些“摇荡”肽就是μ-conotoxinGVIA和μ-conotoxinMVIIA。在神经科学领域，μ-conotox-inGVIA可能会成为仅次于Tetrodotoxin的一种研究工具探针，因为它在抑制突触传递和判断N型钙流是否存在这两方面很有用。 芋螺毒液中均存在众多的不同化学结构的芋螺毒素，但是它们并不是随机性的化学产物，而是有重要生物意义的不断进化优化而生成高生物活性肽，在毒理作用上它们之间具有密切的协同作用，在实现其捕食其他生物的过程中，芋螺并不依赖于某一单一毒素的作用，而是依赖于芋螺毒液中各种毒素的组合作用机制来实现。例如，地纹芋螺毒液中既含有高强度的nAChR拮抗剂（ω-芋螺毒素，又含有Na+通道阻断剂μ-芋螺毒素，前者作用类似于α-银环蛇毒素，后者作用类似于河豚毒素，在这两类芋螺毒素的共同作用下，导致神经肌肉传导完全阻断。 芋螺毒素构象图册参考资料。 芋螺毒素的组合作用机制突出的表现为不同毒理作用之间的协同组合上，亦即以高度组织化的“毒素集团”发挥其功能。已经了解的此种组合作用机制有两种模式。一种模式称为“休克+麻痹”作用，如紫芋螺（C.purpurascens）有两类不同作用的毒素，一类毒素可致被捕食生物立即产生类似电休克式的强直性瘫痪的快速作用，此类芋螺毒素包括可抑制Na+通道失活的δ-芋螺毒素以及抑制K+通道的κ-与κA-芋螺毒素，这些毒素可迅即使轴突纤维完全去极化，导致休克症状。紫芋螺毒液中的另一类毒素包括多类α-及μ-芋螺毒素，则可完全阻断神经肌肉传导，使被捕食生物长时间瘫痪，在这两类不同作用的毒素的共同作用下，紫芋螺等一些食鱼芋螺，既可以迅速捕捉鱼类，又能从容的吞食它们。另一种模式称为“安定+麻痹”作用，如地纹芋螺，被捕食生物进入其口腔时，并不发生被刺咬时常出现的惊厥状况，而是非常安静，表明地纹芋螺使用了不同于“休克+麻痹”的另一种模式，地纹芋螺中富含Conantokin-G、Contulakin-G等芋螺睡眠肽类，这些肽类可使被捕食生物感觉系统钝化失活，处于安定睡眠状态。然后再在α-及μ-芋螺毒素的作用下，进入麻痹瘫痪期，达到捕食目的。 电压门控离子通道超家族是由一大族结构相似的膜结合蛋白组成的，它们受跨膜电压变化的激活。这些蛋白质对单价阳离子具有不同的选择性，按照惯例被分为Ca2+，Na+，和K+通道。这些离子通道的最重要的生理作用是促使细胞电信号的产生、调整和转换。电压门控离子通道的主要孔洞形成α-亚基是由含有4个同源结构域的单一亚基组成的（如Na+和Ca2+通道），或由4个不同的亚基组成（如钾通道）。α-亚基与辅助亚基相互作用并不是完整地形成一个孔洞，而是改变α-亚基的特性。在某种生理状态下，当电压门控离子通道被激活时，会经历一个构象变化，致使阳离子选择性地透过通道蛋白的孔洞。这种处于开放状态的电压门控离子通道可被其另外一种构象变化失活、从而使通道进入不传导状态，或者回到关闭状态。电压门控离子通道是多种生物毒素的作用靶标。越来越多的可与Na+，K+，和Ca2+通道的成孔α-亚基相互作用的芋螺毒素家族被研究鉴定。已知有3个不同的芋螺毒素家族作用于电压门控离子通道，μ-CTX是Na+通道阻断剂、μO-CTX抑制Na+通道的电导率、δ-CTX延迟或抑制Na+通道的快速失活。只有ω-CTX作用于Ca2+通道。 Ca2+通道为所有兴奋性细胞膜的必要成分之一，Ca2+通道是由4或5个不同的亚基组成的复合物。观察到的Ca2+通道在生理学和药理学上的多样性主要是由成孔α1-亚基的特性形成的。据此可分为L，T，N，P，R和Q类型，其中N类型的Ca2+通道只存在于神经元组织（如脊椎动物的中枢神经系统以及外周神经系统），它主要抑制神经递质尤其是去甲肾上腺素从交感神经上释放时Ca2+的进入。基于不同的生理学和药理学特性，电压敏感性钙通道（钙通道）由3个钙通道家族组成，L-型钙电流的通道属于Cav1家族；P/Q-、N-、R-型钙电流的通道属于Cav2家族；T-型钙电流的通道则属于Cav3家族。其中L-型参与一些兴奋-收缩∕分泌偶联和心肌的活动；T-，N-，P-，Q-和R-型参与神经递质的释放。 芋螺通过其鱼叉样小毒箭螫刺伤与其接触的裸潜、捕捞人员、游泳者及其他海洋作业人员,造成局部皮肤损伤,毒素吸收后导致全身中毒。误食或吃法不当也可引起全身中毒。尚无有效的治疗方法,一般采用对症疗法和支持疗法。

在药理学上，芋螺毒素表现为配体和电压门控的NM-DA受体非竞争性拮抗剂。NMDA受体属于离子型谷氨酸受体亚家族，介导Ca2+跨膜内流，为兴奋性氨基酸受体，由3种亚基组成：NR1、NR2（A-D）和NR3（A-B）。NR1是功能亚基，可单独构成离子通道，NR2和NR3是调节亚基，不能单独构成离子通道，分别增强或抑制NR1亚基的功能。NMDA受体发挥功能至少需要NR1和NR2的表达，NR3不是NM-DA受体发挥功能所必需的。研究发现，Con-G特异性拮抗含NR1/NR2B亚基的NMDA受体，Con-T与Con-R拮抗含有NR1/NR2A/NR2B及NR1/NR2B亚基的NMDA受体，而同种conantokins的不同类似物对NMDA受体的拮抗活性也存在差别。由于NMDA受体的亚基组成在生物发育过程中存在时空特异性以及疾病发生、发展过程中的阶段特异性，因此，芋螺毒素对疾病不同发展阶段和不同部位可能存在不同作用。 研究发现，Conantokins4个成员N端前4位氨基酸残基均相同，为分子中的保守序列，足以说明该结构的重要，Con-R与Con-L甚至N端前15位氨基酸均相同。而Con-R对噪声诱导惊厥小鼠的保护指数为17.5，而Con-L的保护指数仅为1.2，表明二者C端序列差异是影响其抗惊厥活性的主要因素。研究发现，Con-R的N端前5位氨基酸残基中任何一个发生改变，多肽的活性都要下降11~1000倍，因此认为Con-R与NMDA受体结合并发生作用的关键序列就是这5个氨基酸残基以及紧随其后的两个转角并与其位于α螺旋同一侧面的其他氨基酸残基。 Conantokins对帕金森病也显示出一定治疗作用。给帕金森病大鼠注射Con-G进行干预，发现它能够呈剂量依赖性地加强左旋多巴诱导的大鼠旋转。另一项研究表明，Con-G可以增强甲基苯丙胺诱导大鼠的行为学效应。其原因可能是甲基苯丙胺可以促进多巴胺释放，Con-G给药间接增强了多巴胺激动剂的药效。该结果提示，conantokins具有治疗帕金森病的临床应用潜力。 芋螺毒素药用研究的其他方向还有：具有去甲肾上腺素转运蛋白抑制作用的T家族芋螺毒素，可用于治疗抑郁症。以及抑制α1-肾上腺素受体的一些芋螺毒素，可用于治疗良性前列腺过度增生引起的尿失禁。

制备芋螺毒素的方法主要有三种方法。第一种是自天然芋螺毒管中直接提取，此方法获取量非常少，且由于海洋生态的破坏使得野生芋螺数量急剧减少，该法会进一步加剧芋螺资源恶化，因此靠分离提取获得大量的芋螺毒素用于研究和生产并不现实，但提取到的少量天然毒液可通过一系列仪器分析手段得到单个毒素肽的氨基酸序列，再根据所得序列人工合成这些肽，可进一步用于活性测试和结构分析。第二种是基因工程方法，即将芋螺毒素的基因转化到微生物中使其表达，后期再进行分离纯化。由于部分芋螺毒素的N端为Cys，酰胺化C端，加之原核表达系统无法加工去除N-端信号肽序列，无法解决酰胺化C端问题，且芋螺毒素分子小，碱性氨基酸较多，难于形成特定活性构象，使得分离纯化较为困难。但随着基因工程技术的日新月异，用芋螺毒素成熟肽基因，加接原核或真核生物的信号肽，或同时转入酰胺化酶基因，可望生产出大量廉价的重组芋螺毒素。 从芋螺的毒管中可提取少量天然芋螺毒素，大多从野生芋螺的死体毒管中提取。或者引诱活体芋螺刺捕猎物，用乳胶套收集喷射的毒液，可收集到几微升毒液。为了充足供应芋螺，美国研究人员在农场里尝试芋螺的养殖，只养了Conuspurpurascens一种，但还不能辨别活芋螺的性别，也未观察到芋螺的交配行为，这说明暂时无法人工繁殖芋螺。因而，靠从芋螺体内分离提取获得大量的芋螺毒素用于研究和生产是不现实的，天然来源的芋螺毒素十分有限，这制约了芋螺毒素研究的开展和应用。但获得的少量天然毒液可用高效液相色谱仪进行分离和分析，通过质谱仪和序列分析，可得到单个毒素肽的氨基酸序列。
研究中使用的芋螺毒大多数是毒液排出管抽提物。对于大多数芋螺种来说，这些抽提物勉强用于研究。但也有例外，如一种产自东太平洋猎食鱼的种类称为紫纹芋螺（C.purpurascens），其抽提物量不足以用于生化研究。可以先将紫纹芋螺饲养在水中洞穴中，用吹胀的塑料套子在金鱼身上摩擦，芋螺从沙子中跑出来，吸吮着套子，随套子浮在水面上。或Eppendorf试管，挖去盖子，放一些鱼鳍在试管中，再在鱼鳍上面放上一层薄膜，芋螺试图吸吮试管，便将毒液排入试管中。每收集3-5mL毒液需要耐心地多次用这种方法不停地累积。 芋螺毒素是基因直接表达的产物，现代基因工程技术也促进了芋螺毒素的研究与开发。在研究芋螺毒素基因的结构和生物合成过程，寻找新芋螺毒素基因，研究其分子遗传学机制，蛋白质折叠机制方面有重要的应用，且已取得了较快的进展。构建芋螺毒素cDNA文库，从中筛选新芋螺毒素基因已成为研究新芋螺毒素及其分子特征的重要途径之一。
芋螺毒素在体内先合成较大的无活性多肽前体，它们由50~80个氨基酸残基组成，含有典型的信号肽序列区和可变区，在近成熟肽区位置，有标准的蛋白质水解信号，这些信号肽序列在所有超家族成员中具有保守性。同一超家族的芋螺毒素成员具有高度保守的信号肽序列和高度保守的二硫键连接方式。如MVIIC，MVIID，SⅥA，SⅥB和SO3是根据已知ω-毒素毒素肽氨基酸保守序列，合成特定的探针，从中筛选出来的。其他国家已构建了织锦芋螺（C.textile），幻芋螺（C.magus），地纹芋螺（C.geographus），金翎芋螺（C.penaceus）等几种芋螺的cDNA文库。同时根据信号肽及3’端非翻译序列，设计芋螺毒素各个超家族基因的特异PCR引物，从cDNA和基因组DNA中克隆新型毒素基因成为可能，且是分离芋螺毒素基因的主要方法。
研究人员从3种芋螺（C. livi-dus、C.abbreviatus和C.ebraeus）中测出了284个四环芋螺毒素前体蛋白基因序列，又从另外5种芋螺（C. arena-tus，C.pennaceus，C. tessulatus，C.ven-tricosus和C. textile）中获得了170个芋螺毒素的cDNA序列。他们都在GeneBank中申请了序列号。中国海南浅纹芋螺（C.striatus）和织锦芋螺（C. textile）中也分别发现了6种新O-超家族毒素的cDNA序列和2种α-CTX。地纹芋螺（C.geographus）基因组DNA则用PCR法克隆到新型α-CTX GIC。
中国海南产的大理石芋螺（Conus marmoreus Linnaeus）、幻芋螺（Conus magus Linnae-us）、信号芋螺（Conus litteratus Linnaeus）、勇士芋螺（Conus miles Linnaeus）、独特芋螺（Conus caracteristicusFischer）、织锦芋螺（Conus textileLinnaeus）、桶形芋螺（ConusbetulinusLinnaeus）、疣缟芋螺（Conus livi-dusHwass）等共12个种中分别发现了具有药用功能的35种O-超家族芋螺毒素肽及其基因。根据毒素基因推测出相应的毒素氨基酸序列，通过人工合成或基因体外重组表达出这些芋螺毒素，进一步研究其活性，这些毒素即是新药开发的候选药物和先导药物。但部分ω-芋螺毒素的N端为Cys，C端酰胺化，加之原核表达系统无法加工去除N-端信号肽序列，无法解决C-端酰胺化问题，且ω-芋螺毒素分子小，碱性氨基酸较多，难于形成特定活性构象。 采用人工化学合成的方法，即通过分离天然芋螺毒素后测序或采用基因克隆方式获得芋螺毒素序列，然后采用人工化学合成获得更多量的芋螺毒素，较多使用的是多肽固相合成法。与传统的多肽液相合成法相比，该法具有如下优越性：只需经过过滤和冲洗，就可以将产物多肽从可溶性试剂中分离开来；易于使用自动化设备；过量的反应试剂促使反应彻底进行；反应产物多肽一直结合在固相载体上，损失量将达到最小。根据氨基端保护基的不同，固相合成芋螺毒素常用方法为Fmoc法和Boc法。Fmoc法具有反应条件温和、副反应少等特点，大多芋螺毒素的合成都采用该方法。合成后将肽链从树脂上裂解下来，常用的裂解剂为reagentK试剂（trifluoroaceticacid∶water∶ethanedithiol∶phenol∶thioanisole，90∶5∶2.5∶7.5∶5）。接着脱去侧链保护基、复性、纯化，即可得到与天然毒素活性相同的肽，也可以合成其同系物进行结构和功能的研究。但由于ω-芋螺毒素氨基酸残基较多，一般都在25个以上，其人工合成的产率较小，纯度也低，合成的肽还需氧化折叠才能形成正确的构象。氧化折叠的方法有空气氧化法、DMSO、DTT/cysteine、gluthatione氧化法等。
研究人员在合成ω- CNVIIA时，对这几种氧化折叠方法作了比较，发现gluthatione氧化法效果最好。随后进行纯化，即可得到具有天然毒素活性且纯度较高的多肽，最后利用NMR技术进行构象分析。因此，人工合成芋螺毒素的成本较高，还不能完全满足作为药物商业化生产的要求。但由于芋螺毒素药物的用量小，效果好，价值高，可部分满足市场需求。 随着对芋螺毒素研究的深入和多肽合成技术的进步，芋螺毒素的合成方法也不断改进。Ale-wood小组将硒代半胱氨酸引入，合成了3个α-芋螺毒素ImI的类似物。具体操作是用硒代半胱氨酸代替了其中的1对或者2对半胱氨酸，形成二硒键替代了原有的二硫键，显著提高了芋螺毒素的氧化折叠效率，NMR和CD谱都表明类似物和天然的ImI在结构上十分相似，并且保持了原有的生物活性。可采用硒代半胱氨酸代替半胱氨酸合成了μ-芋螺毒素SIIIA类似物，并且使用同位素标记了1对半胱氨酸，在提高了合成效率的同时确定了二硫键的连接。
有研究人员在利用微波合成法合成了α-芋螺毒素MII的过程中，比较了使用微波合成法和经典的固相合成法。结果表明使用微波合成的产率更高，从77%~89%提高到75%-93%。更重要的是使用微波加热缩短了每个反应周期的时间，由1-2h减少到12-15 min。如果把微波用于环状肽α-芋螺毒素IMI合成，合成效率也有所提高。此外，芋螺毒素的合成还有很多其它的策略，如μ-MrIA和α-MII采用N-C骨架环化的方法合成。还有科学家利用内酰胺、硫醚等代替二硫键，研究芋螺毒素的折叠产率。 芋螺毒素的化学合成是获得芋螺毒素的重要方法，也是进一步研究芋螺毒素活性与结构的基础。关于芋螺毒素线性肽的合成研究已较深入，合成过程中最主要的问题是二硫键如何正确连接。针对不同的芋螺毒素合成，一般是在原有研究基础上，进一步摸索适宜的保护基团和折叠方法。在线性肽的合成过程中，应优化反应试剂，减少副产物的形成，缩短反应时间，提高合成效率。
自从20世纪80年代中期合成α-芋螺毒素GI和MI以及ω-芋螺毒素GVIA以来，有数百种芋螺毒素肽都通过多肽固相合成法（solidphase peptide synthesis，简称SPPS）合成。方向是从C端到N端。每一个氨基酸连接由以下几个过程组成：首先是去保护，即保护氨基酸必须用一种碱性溶剂去除氨基的保护基团；其次是氨基酸活化，即下一个连接的氨基酸羧基被一种活化剂所活化；最后是偶联，活化的单体和游离的氨基反应，形成肽键。以上3步循环进行，直至所需的肽合成完毕。
在合成过程中，氨基酸保护基团对合成有着重要影响，特别是一些易于氧化的氨基酸，如Met，Trp等，选择适宜的保护基团可以减少副反应发生。由于芋螺毒素富含半胱氨酸，所以在合成时半胱氨酸保护基团需要慎重考虑。在固相合成中，半胱氨酸有10种以上的保护基团供选择。这些保护基团对酸碱或金属离子的稳定性不同，可以根据这一特点脱去保护基团，从而可以形成游离的巯基、硫醇盐或者直接脱去保护基团且同时形成二硫键，在这个过程中，切割液起着决定性作用。S-Trt、S-Tmob、S-Xan是芋螺毒素合成中常用的半胱氨酸保护基团，对酸不稳定，因此可与其它的保护基团一起用TFA等切割液脱去形成游离的巯基。S-Acm对酸很稳定，可用于Boc或Fmoc合成中，一般用I2或者Tl（tfa）3直接脱去并同时形成二硫键，也可以在汞盐的条件下脱去并形成游离的巯基，这时要注意His，Met，Trp或者Tyr，它们都有可能被氧化。在Boc合成中，最常用的保护基团是S-MeBzl和S-MeOBzl，它们都对TFA很稳定，但可以用HF脱去。若S-Fm用作半胱氨酸的保护基团，就能先于树脂被脱除。适宜的氨基酸保护基团可以减少合成过程中的副反应，提高合成效率。
由于天然芋螺毒素含有特定的二硫键连接方式，因此如何合成特定二硫键连接方式的多肽成为合成中最大的难题，也是限制获得大量天然芋螺毒素的关键因素。在芋螺毒素合成过程中，二硫键形成一般通过以下两种方法：第1种为游离的巯基形成二硫键；第2种为半胱氨酸脱保护直接形成二硫键；，因芋螺毒素一般含有多对二硫键，一般情况下需综合使用上述两种方法。游离的巯基形成二硫键在芋螺毒素的合成过程中，半胱氨酸的保护基团如果是S-Trt、S-Tmob、S-Xan等，经过切割后就会形成游离的巯基，这些巯基需进一步自由氧化形成二硫键。这是芋螺毒素合成最常用的策略。游离的巯基形成二硫键的方法有多种，如空气氧化法、二甲基亚砜氧化法、固相埃尔曼试剂法、铁氰化钾氧化法等。一般认为此法形成的终产物受热力学控制，反应产物为水，纯化步骤少。但由于芋螺毒素含多个半胱氨酸，自由氧化后会形成多种同分异构体。含两对二硫键可以形成3种异构体，如α、ρ、τ、χ等家族芋螺毒素。如果含有6个半胱氨酸理论上会形成15种异构体。研究者已经摸索多种方法，研究体外条件下二硫键形成的机制。结果表明芋螺毒素本身的性质和外界因素都对二硫键的连接有着一定程度的影响。如Shigeiu等研究了盐浓度和温度对ω-芋螺毒素MVIIC折叠的影响。结果显示在5℃时氧化的效果最好，天然构象的产率随着温度的上升而下降，而2.0mol·L-1（NH4）2SO4可以大大提高ω-芋螺毒素MVIIC的正确折叠效率。Cruz等研究了去污剂对疏水性δ-芋螺毒素PVIA氧化折叠的影响，结果表明加入去污剂后天然产物的比例大大提高。Miloslavina等研究了离子化溶液对芋螺毒素折叠的影响，结果表明离子化溶液可以提高亲水性和疏水性肽的氧化折叠效率。此外，前体肽和二硫键异构酶作用以及酰胺化等对芋螺毒素二硫键形成也都有一定程度的影响。半胱氨酸脱保护定点形成二硫键芋螺毒素含有多对半胱氨酸，每一对半胱氨酸可以采用不同的基团保护，合适的脱保护试剂脱去保护基团，定点形成二硫键，这是形成芋螺毒素二硫键正确连接的常用方法之一，此法可以定点形成二硫键，为构象研究提供了方便，但也需要注意Met、Trp等这些敏感的氨基酸可能会发生副反应。含有2对二硫键的α-芋螺毒素GI即采用此种方法被合成，其半胱氨酸分别用Acm和MeBzl保护，用HF/anisole脱去MeBzl保护基团，铁氰化钾氧化形成第1对二硫键，然后利用I2脱去Acm并且直接形成第2对二硫键，合成α-芋螺毒素GI时，在脱去MeBzl的同时，树脂也被切割。而Alewood等对定点合成α-芋螺毒素GI进行了进一步探索，即首先在树脂上形成二硫键，最后切去树脂，具体为先用巯基乙醇/DIEA/DMF脱去Fm保护基团形成第1对二硫键，之后再利用I2脱去Acm并且直接形成第2对二硫键，最后才使用HF脱去树脂。
另外，还有一种新的定点形成二硫键的方法，称为一罐法（One-pot method）。即两对半胱氨酸分别用t-Butyl和4-methylbenzol基团保护，在5%DMSO/TFA和25℃条件下，t-Butyl保护基团被脱除，再将温度升高到70℃脱去4-methylbenzol基团。研究人员利用两步法和一罐法均合成了α-芋螺毒素ImI，并且比较二者合成效率，结果表明一罐法合成效率更高。
O-、M-等超家族芋螺毒素比较特殊，因为含有3对二硫键，一般自由氧化和定点形成二硫键相结合来合成。如ω-芋螺毒素MVIID，此肽含有6个半胱氨酸。首先用S-Trt保护Cys1，Cys3，Cys4，Cys6，Cys2，Cys5用S-Acm保护。先用切割液脱去树脂和S-Trt保护基团，形成4个游离的巯基，空气氧化形成2对二硫键，剩下的1对保护基团采用I2脱去并形成第3对二硫键。含有3对二硫键的芋螺毒素还可以采用三步法合成，即每一步都形成1对二硫键。Durieux等利用S-Trt，S-Acm和S-MeOzl3种保护基团，分3步切割形成二硫键合成了ω-芋螺毒素MVIIA。

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丁青县13022158965： 芋螺毒素是什么成分? - ？
舒谦萨尔： 芋螺毒素(conotoxin或conopeptide,或CTX),由海洋腹足纲软体动物芋螺(Conus)的毒液管和毒囊内壁的毒腺所分泌,由许多单一毒肽组成的鸡尾酒样的混合毒素,主要成分是一些对不同离子通道及神经受体高专一性的活性多肽化合物....

丁青县13022158965： 鸡心螺是通过什么方式释放毒液的? - ？
舒谦萨尔： 通过毒牙释放毒液 鸡心螺的毒液中含有数百种不同的成分,而且不同种类之间的成分组成有很大的差异,它的毒液通过毒牙释放.

丁青县13022158965： 17个月的宝宝莫名其妙的发烧是怎么回事？
舒谦萨尔： 属于生长期间的发烧,常见长牙齿、长高(抽条)等.小孩玩得太累也是发烧原因之一

丁青县13022158965： 海洋有毒动物的芋螺科 - ？
舒谦萨尔： (Conidae)是属于本身含有毒素的海洋软体动物,分布于热带和亚热带海域.芋螺俗名鸡心螺,中国已鉴定的有30余种,其中以线纹芋螺、地纹芋螺和纹文芋螺毒性较大.中毒的症状为呕吐、剧痛,重者呼吸困难、运动失调,曾有致死记录.

丁青县13022158965： 7个月的宝宝拉肚子,肠胃不好怎么办 - ？
舒谦萨尔： 亲,宝宝应该是消化不良引起的拉肚子了.给宝宝吃点妈咪爱吧 ,调理肠胃助消化的;再吃点思密达,止泻的.多给宝宝揉揉小肚子,促进肠胃蠕动的.如果母乳喂养的话,宝妈饮食要注意,一定要清淡,不要吃很油腻的东西和不好消化的东西,这些都容易刺激宝宝的肠胃,造成消化不良和拉肚子的.宝宝肚子不舒服跟母亲饮食有很大关系的. 肚子不舒服不要乱给她吃东西,只喝奶就行. 如果还没有好转就要去打打针了.

丁青县13022158965： 脸上下巴总是长痘痘?是身体的哪里出现问题了呢 - ？
舒谦萨尔： 下巴长痘痘的原因 1、内分泌失调. 有的是因为子宫或卵巢等生殖系统问题,或是加上通经、月经不调的显现,导致你的内分泌不正常,荷尔蒙分泌失衡,导致下巴痘痘的产生. 2、油脂分泌过盛. 皮脂腺过于发达,与个人体质以及天气有关,...

丁青县13022158965： 芋螺肽能长期使用吗? - ？
舒谦萨尔： 芋螺肽是可以长期使用的,芋螺肽比起他的胜肽类的成分,比如八胜肽,六胜肽等更温和,长期用皮肤不会僵硬,适合敏感肤质使用.芋螺肽是高度折叠的胜肽,强力穿透,高稳定性,目标性的针对肌肉达到放松的作用.芋螺肽目标性的阻断电...