PCR产物克隆的方法和优缺点
【TA 克隆的优缺点】
1、优点:
(1)是目前克隆 PCR 产物最简便、快捷的方法。
(2)不需使用含限制酶序列的引物,不需将 PCR 产物进行优化,不需把 PCR 产物做平端处理,不需在 PCR 扩增产物上加接头,即可直接进行克隆。
(3)TA克隆选择灵活,如果一个位点不好使用,同一批质粒还可以用其他酶再切,随时可以扩增。
(4)方便下游作业,比如说要连接两端PCR产物,先克隆会比较方便一些。
2、缺点:
(1)PCR产物的酶切和判断比较困难。
(2)另外酶切连接过程本身也相当地费时费力。
【TA 克隆】TA 克隆方法( Original TA Cloning Kit )即利用 Taq 聚合酶同时具有的末端连接酶的功能,在每条 PCR 扩增产物的 3` 端自动添加一个 3`-A 突出端。利用 TaKaRa 的 T 载体,直接高效地连接 PCR 产物。随着基因组计划的进行,以及分子生物学技术、基因芯片技术在生命科学研究、生物工程和医学等领域的应用,对 TA 载体的需求量会逐步扩大。
一、缺点:
1、PCR产物的酶切和判断比较困难。
2、另外酶切连接过程本身也相当地费时费力。
二、优点:
1、克隆PCR产物较简便、快捷的方法。
2、不需使用含限制酶序列的引物,不需将 PCR 产物进行优化,不需把PCR产物做平端处理,不需在 PCR 扩增产物上加接头,即可直接进行克隆。
扩展资料:
T-A克隆由于在PCR过程中,使用的DNA聚合酶不同,往往分为2种情况:
1、使用高保真的DNA聚合酶,如pfu酶,由于其不能在扩增产物的3末端加上A,得到的DNA序列为钝端,因此,需要在回收纯化后进行加A的过程,通常是以PCR回收产物为模板,加上一定量的普通Taq酶和反应液,加入dATP(或dNTP), 72℃ 10分钟,然后将加A产物直接用于TA连接。
2、使用不同的Taq酶,在PCR扩增循环结束后,加上72℃ 10分钟一个过程,Taq酶可以在扩增产物的3末端加上A,因此PCR产物回收纯化后可以和T载体直接连接。
参考资料来源:百度百科-T-A克隆
1.T/A cloning
这种克隆方式利用的是,一般PCR所用的DNA聚合酶具有在PCR产物3‘端添加一个碱基A的特性,也就是说,实际上常规PCR的产物并不是平末端的,而是有一个突出的A碱基,为了对PCR产物进行高效的克隆,人们开发出了一种专门用于PCR产物克隆的载体--T载体,T载体是一个线性化的载体,其末端是一个突出的T,正好与PCR产物上突出的A配对,所谓的T/A克隆就是将带有突出A尾巴的PCR产物与T载体连接,然后转化宿主菌的克隆,这种克隆效率非常高,很容易成功,应用也非常广泛,常用于下游克隆操作前的PCR产物测序鉴定和方便对PCR产物进行酶切处理。
2.Restriction stick end cloning
翻译过来就是限制性粘末端克隆,就是在PCR扩增引物的设计过程中,在引物中添加特定的酶切位点,这样经过PCR扩增后,得到的片段两端就带有需要的限制性酶切位点,对PCR产物进行酶切后,就可以直接与目的载体进行连接,实现克隆。这种方式省略了T/A克隆,一步到位,但是由于酶切位点位于片段末端,常常导致酶切效率较低,需要较长时间,必须设计好保护碱基。
3.Blunt-end cloning
所谓的平末端克隆,就是用Klenow片段将PCR产物末端突出的A碱基补平,然后与带有平末端的载体进行平末端克隆,平末端克隆效率很低,这种方式一般应用的很少,只是当PCR扩增所用的酶是高保真聚合酶如Pfu时,因为这种酶不会再PCR产物末端添加额外的碱基,PCR产物为平末端的,这时可能会用到平末端克隆,其实对这种PCR产物进行一个加尾处理,再进行T/A克隆,可能更加简单一些,呵呵。
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龙华区15636688960: 如何提高PCR产物克隆的效率 - ?
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龙华区15636688960: PCR技术和 基因工程的优缺点分别是什么 - ?
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龙华区15636688960: 关于生物PCR技术 - ?
广趴康宝: 首先pcr比较快,人体的dna从解旋到复制再到形成双联的dna分子是很复杂的,其次人体在复制dna的时候不排除有突变的可能,而pcr技术采用的是人工的将基因片段剪切和拼接,使用的是各种dna的酶,比如dna聚合酶就是最重要的一个,酶又是高效的催化剂,所以可以降低反应的时间和突变的可能而pcr技术采用的是人工的将基因片段剪切和拼接
龙华区15636688960: 如何确定TA克隆的方向 - ?
广趴康宝: 一般只能通过测序才能确定目的基因的插入方向.
龙华区15636688960: 从克隆载体上PCR出目的基因原理 - ?
广趴康宝: 克隆载体是环状双链DNA.PCR的原理: 首先,当热变性,模板双链分开成两条单链模板 然后,两条引物分别结合上各自的模板 聚合酶,催化dNTP等进行引物延伸,成为两对长链模板,由于延伸的时间只够完成目的基因的长度,是不足以完成整个环状的延伸的.所以得到模板的互补链是有头有尾的. 这是一个循环. 再热变性,刚刚由引物变成的模板,解开成两条单链.新引物分别结合到两条模板上,延伸.引物结合模板,不断的变成新模板. 当然,新模板以旧模板为模板合成.而引物特异性结合位点确定了新的模板的长度.
龙华区15636688960: 求PCR介导定点诱变的优缺点是什么? - ?
广趴康宝: 优点:1.突变体回收率高.一些改进的方案可使回收率达到近100%.2.快速简便.能用双链DNA作模板,不需制备单链模板,因而不需要将目的DNA亚克隆到单链噬菌体载体上.3.高温度的利用,可降低模板DNA形成二级结构的几率.4.所有反应可以在同一试管中进行. 缺点:1.PCR扩增DNA时会产生一定程度的碱基错配,除预定突变外常包含一些非预定突变.2.在扩增的DNA的3'末端加上非预设的碱基.3.对每套引物和模板,PCR反应都需要优化.4.标准PCR不能有效扩增大于3kb的DNA片段.
龙华区15636688960: pcr技术采用什么方法从不同dna分子中分离出等长的dna分子 - ?
广趴康宝: p完后跑个胶,在胶上位置一样的DNA分子等长,然后切胶回收即可
龙华区15636688960: 克隆技术的利弊 - ?
广趴康宝: 选自2000年11月8日《文汇报》 我们所说的生物技术的利和弊主要指的是克隆,其利和弊是 利:1) 克隆技术可解除那些不能成为母亲的女性的痛苦. 2) 克隆实验的实施促进了遗传学的发展,为“制造”能移植于人体的动物器官开辟了前景...