怎样进行组织培养?
(1)外植体的选择。外植体是指从植物体上切取下来,用于组织培养的部分,如顶芽、茎尖、侧芽、花器、鳞片等。一般说来带芽的外植体如茎尖和侧芽等,它们产生幼苗的成功率高,而且很少发生变异,容易保持材料的优良特性。由分化组织构成的外植体,如茎段、叶、根、花茎、花瓣、花萼、胚珠、果实、花粉等,它们大多由已分化的细胞组成,由它们再生成幼苗,要有一个从分化状态回复到分生组织状态的脱分化过程,由这类外植体接种的材料,常常要经过愈伤组织阶段再分化出芽或胚状体而形成幼苗,形成的后代可能有变异。
(2)外植体的灭菌。取得外植体后必须进行严格的灭菌,这是因为外植体常常附有多种多样的微生物,这些微生物一旦被带进培养基,就会迅速滋生,使组织培养前功尽弃。在将各种微生物杀死或清除的同时,必须保持外植体的生活力。
先用流动的自来水冲洗10~20分钟,脏的外植体用洗衣粉洗涤,或用毛刷、毛笔轻轻刷洗,去掉污物,冲洗后用滤纸吸干外植体的表面水分。在70%的酒精里浸泡15~30秒钟,用无菌水冲洗两次。然后用适当的药剂消毒,经常使用的灭菌剂有次氯酸钠、过氧化氢、漂白粉和低浓度的氯化汞等。使用这些灭菌剂,都能起到表面杀菌的作用。具体使用的浓度和浸泡的时间因外植体的种类和药剂而定。如用2%~10%次氯酸钠水溶液浸泡3~15分钟。灭菌后立即用无菌水冲洗3~5次,洗去药液,用无菌滤纸吸干水分,准备分离。
(3)外植体的分离。在超净工作台上进行分离。提前15~20分钟开机,并用70%的酒精擦拭台面。点燃酒精灯用于工具的消毒。如果使用的外植体太小操作困难,可在解剖镜下进行。外植体小的用大头针将其固定在橡皮塞上,然后在解剖镜下分离切取。用无菌刀、剪、镊子等,在无菌的环境下,剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮等,叶片不需剥皮。然后切成0.2~0.5厘米厚的小片,就可以植入培养基了。在操作过程中严禁用手触动材料。
(4)外植体的植入。在超净工作台上打开装有培养基的瓶或试管。在酒精灯的火焰上烤一下瓶口或试管口,再开启瓶盖。在无菌环境下,将切好的外植体立即接在培养基上,组织培养育苗最常用的培养基为MS。每瓶接种4~10个。再在火焰上烤一下瓶和瓶盖。接种后,立即盖上瓶盖,试管用无菌药棉塞上。及时写好记录,贴上标签。
(5)诱导。消毒后的外植体在诱导培养基上培养一段时间后可诱导出丛芽、胚状体、原球茎、根状茎,我们将这些培养材料称为中间繁殖体。外源的生长素类物质对诱导细胞开始分裂效果很好,组织培养育苗是必须使用的。最常用的为6-苄基腺嘌呤,常用浓度为1~2毫克/千克。萘乙酸、吲哚丁酸、吲哚乙酸。后3种药剂既在配制生根培养基时应用,又常在诱导、增殖和壮苗时使用。
(6)中间繁殖体的增殖。对中间繁殖体进行切割、继代培养就可以进行中间繁殖体的增殖。中间繁殖体的增殖速度随花卉的种类、培养基、培养条件的不同而异,因而对具体花卉需进行试验,找到合适的繁殖条件。当中间繁殖体增殖到一定数量后快速繁殖进入生芽、壮苗和生根阶段。如果是通过丛芽繁殖,则不需经过生芽直接进行壮苗、生根,如果是通过其他途径则需先将中间繁殖体转移到生芽培养基上,然后再转移到壮苗生根培养基上。在壮苗生根培养基上,大多数花卉要分离成单苗。
(7)生根。继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根,要促使试管苗生根,必须转移到生根培养基上,生根培养基常用1/2MS培养基,无机盐浓度低有利于根的分化。同时,不同花卉诱导生根时所需要的生长素的种类和浓度是不同的,常用生长素萘乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸。一般在生根培养基中培养1个月左右即可获得健壮根系。
(8)试管苗移栽。对已经生根的试管苗及时移栽是组织培养育苗的最后工作。由于组织培养苗是在无菌、有营养供给、适合光照、温度和100%相对湿度环境中生长的,因而刚出瓶的试管苗对外界环境不太适应,稍有不慎就会造成大量死苗。出瓶前1~3天打开瓶盖,让幼苗锻炼,适应外部不良环境和对病菌的适应能力,但不能太早,以免培养基生长霉菌。对刚出瓶的组织培养苗要细心管理,控制适当的温度、弱光照、较高的空气湿度、适宜的基质及对病虫害的有效控制。
(9)操作过程注意事项。在整个操作过程中,工作人员必须用肥皂和流动的自来水把手洗干净,带上口罩、帽子,穿上工作服,接种前双手用70%的酒精擦拭,工作时不说话。
①外植体的选择、消毒及茎尖接种
在春季4月份将已开始萌动的枝条,即芽膨大而芽鳞片尚未开裂时,采用11—93茎尖作外植体,剪成具有一个生长点的茎段,剥去韧皮部后,在用70%的酒精中浸洗1分钟,转入0.1%HgCl2溶液中消毒5—7分钟,再用无菌水冲洗三次,在无菌条件下,剥离0.5毫米的生长点接种。
②继代培养
将生长点接种在MS+BA0.5+IAA0.2+GA0.25的培养基上,光照强度为3000勒克斯,白天温度25—28℃,夜间温度18—20℃,光照时间10小时左右,茎尖10—15天膨大,迅速生长、分化、增殖,经过约60天培养,每个生长点可形成10余个芽丛,然后再转接到MS+BA0.2+IAA0.1+GA0.5的生长培养基上。为加快繁殖,GA的用量可增加到1.0,这样经过多次反复继代切割培养。一个生长点经过继代6次培养,繁殖系数可以达到500倍左右,即可生长成为株高为2—3厘米的丛生苗。1992年接茎尖22个,繁育试管苗达1.43万余株。平均株高2.5厘米,茎粗0.3厘米的无根苗。
③根的诱导
经过继代培养的无根苗,于1993年2月开始陆续剪取高为2厘米左右的茎段转入1/2MS+IAA1.0;1/2MS+IAA1.5;1/2MS+IAA2.0;1/2MS+IAA1.0+IBA0.2;1/2MS+IBA0.5+IAA1.0;1/2MS+IBA0.5;1/2MS+IAA1.5+NAA0.2以及1/2MS+IAA2.0+IBA0.3和1/2MS+IAA2.0+NAA0.2等多个生根培养基上,其生根率分别为26.6%—88%。经过对比试验,筛选出最佳的生根培养基,即1/2MS+IAA2.0+IBA0.3。试管苗生根率的高低是直接影响组培苗移栽成功的基础,大量的试管苗还能生长出健壮优质的根,1993年共生根5351株。
图8 舌接法
1.接穗 2.砧木 3.接合
专家解答
组织培养繁殖法是利用细胞的全能性和组织的再生能力,切取草莓植株的部分组织或器官,在无菌条件下,接种到人工配置的培养基上,使之发育成完整的植株。草莓组织培养繁殖的优点是:
(1)植株健壮结果好任何植物在长期的无性繁殖过程中都容易感染病毒,受到病毒感染的植株生活力衰退,产量降低,品质变劣。而组织培养繁殖的整个过程是在无菌环境中进行的,对于做繁殖材料的茎尖也要进行脱毒处理,这样所得的秧苗不含或少含病毒,比一般秧苗叶片大而厚,叶色浓绿;生长健壮且整齐一致;结果期延长3周,平均增产20%左右;果个大,品质优。
(2)繁殖速度快利用组织培养法繁殖草莓,一年内一个分生组织可获得几千株甚至几万株秧苗,这种繁殖方法对加速新品种推广,特别是对抽生匍匐茎低的品种的繁殖更为有利。
(3)繁殖不受季节限制组织培养是在操作室和配套温室中进行的,不受外界环境条件的影响,一年四季均可生产,在人工控制条件下,可进行工厂化育苗。
(4)节省土地,利于种质保存用组织培养法繁殖是在实验室中进行的,对露地占用少。所以,不仅节省土地,便于管理,而且对保存种质资源更加安全。
组织培养繁殖有以下几个步骤:
(1)配制培养基常用的培养基是MS培养基、怀特培养基,其配方见表11。
①配制母液。将营养成分中大量元素扩大10倍,微量元素扩大100倍。把大量元素、微量元素、有机生长物质分别贴上标签,放在3~5℃环境中待用。植物生长调节剂如6-苄基嘌呤、激动素用少量0.5摩尔/升的盐酸溶解,萘乙酸用酒精溶解,溶解后加水稀释。
②培养基配制。将所要用的琼脂加热溶解,加入蔗糖搅拌,配制成琼脂-蔗糖液。然后按量把配制好的母液置入准备好的容器中,接着把琼脂-蔗糖液也置入同一容器中,充分搅拌,定容到规定的体积。
③调整酸碱度。琼脂培养基加热灭菌时,pH会降低0.1~0.3,所以在加热前用0.1摩尔/升的盐酸或氢氧化钠液调整培养基的pH。
④高温消毒。把培养基趁热注入试管或三角瓶内,注入量为容器容积的1/3左右,塞上棉塞,缚紧,放入高压蒸汽锅内灭菌。蒸汽锅压力维持在78.5~98千帕,时间为10~20分钟。
单位:毫克/升序号化合物MSWhite1硝酸钾(KNO3)1900802硝酸铵(NH4NO3)1650-3四水硝酸钙[Ca(NO3)2·4H2O]-3004硫酸钠(Na2SO4)-2005七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)3707206七水磷酸二氢钠(NaH2PO4·7H2O)-16.57磷酸二氢钾(KH2PO4)170-8氯化钾(KCl)-659一水氯化钾(KCl·H2O)440-10四水硫酸锰(MnSO4·4H2O)22.37.011七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O)8.63.0表11营养基配方序号化合物MSWhite12硫酸铁[Fe2(SO4)3]-2.513五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.0250.00114氧化钼(MoO3)-0.00115硼酸(H3PO3)6.21.516碘化钾(KI)0.830.7517六水氯化亚钴(CoCl2·6H2O)0.025-18二水钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)0.25-19肌醇10010020烟酸0.50.321盐酸硫胺素0.40.122盐酸吡哆醇0.50.123甘氨酸2.0324蔗糖300002000025琼脂100001000026pH5.85.6表11营养基配方(续)-1(2)选材与消毒选取健壮植株上充实、小叶尚未展开的匍匐茎先端3厘米左右的幼嫩组织作培养材料。将材料用洁净流动的清水冲洗0.5~1个小时,然后用70%的酒精浸泡1分钟,再用0.1%升汞水浸泡7分钟,最后用无菌水冲洗2~3次。
(3)接种在无菌的超净工作台上,用镊子去掉茎尖组织的叶片,在解剖镜下,用消过毒的刀片切取茎尖分生组织0.3~0.5毫米大小,放入备用的培养基上。
(4)初代培养将接过种的试管或三角瓶放置在温度25~28℃,光照强度2000勒克斯,每天照射10小时的无菌条件下进行培养。10~15天接种物开始萌发,再经7~10天接种物产生很多小芽,形成芽丛;3个月后,无根苗长至3~4厘米。这时初代培养结束。
(5)继代培养当初代培养的无根苗长到3~4厘米时,将其取出进行生根培养。把剩下没达到3~4厘米的芽,按3~4个芽为一个芽丛重新分开,再重新植入同种培养基(初代培养基)上进行增殖培养,这种增殖培养称继代培养。1个月左右新的一批无根苗又繁殖出来,再用同种方法进行下一次继代培养。
(6)生根培养将初代培养或继代培养的高度已达到3~4厘米的无根苗,扦插到珍珠岩内进行生根培养。生根培养的苗床温度保持在18~20℃,空气湿度在80%以上,珍珠岩中要喷洒营养液和生根素。20天以后,当秧苗长出3~4条,长度达1.5~2.5厘米的根系时,可进行移栽锻炼。目前国内比较常用的营养液配方见表12。
化合物名称园试配方化合物用量毫克/升毫摩/升元素含量(毫克/升)大量元素总计(毫克/升)Ca(NO3)29454N112Ca160KNO38098N112K312NH4H2PO41534N18.7P41MgSO4.7H2O4932Mg48S64Na2Fe-EDTA20-Fe2.8H3BO32.86-B0.5MnSO4·4H2O2.13-Mn0.05ZnSO4·7H2O0.22-Zn0.05CuSO4·5H2O0.08-Cu0.02(NH4)6Mo7O24·4H2O0.02-Mo0.01N243P41K312Ca160Mg48S64表12营养液配方注:参引2001年张福墁主编《设施园艺学》。
(7)移栽当秧苗已长出3~4条1.5~2.5厘米长新根时,可移栽到室外进行土壤育苗。移栽后的前两周应覆盖薄膜与覆盖遮阳网,保持土壤和空气湿度,缓苗后撤除覆盖物。
提示板
组织培养能培育优质的壮苗,但技术要求比较严谨,目前还只在科研院所进行。随着科技的进步,大型繁育场将逐步得到推广。无毒育苗将是草莓苗木繁育的主要手段。
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门头沟区18276637096: 如何对植物组织培养啊?我想种草药,但没有苗自己想组培,怎么组织培养啊? - ?
满顺安卜: 组织培养技术 详见 1、http://baike.baidu.com/view/44612.htm 2、http://baike.baidu.com/view/95402.htm