pcr的关键性技术

pcr技术最关键的地方、？~

最关键的是引物设计，引物设计适当的话在后面的实验可以减少很多调试的工作，如果引物设计不当的话，做很久都可能做不出目的基因。所以，如果你是第一次做PCR的话，建议你设计2～3对引物，或者找引物合成公司替你设计引物。

PCR技术概论

http://shiyan.ebioe.com/PCRPE-CetusMullisTaqDNA_3.htm

(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。

PCR技术简史

PCR的最早设想 核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。

PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA ，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。

PCR的改进与完善最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温， 90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。

1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。

1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。 此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。


PCR技术的基本原理

PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。


。 到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝

PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。 反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种效应称数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。


PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中， 以两条互补的DNA为模板，引物是从3'端开始延伸， 其5'端是固定的，3' 端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时， 由于新链模板的5'端序列是固定的， 这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点， 保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加， 而“长产物片段”则以算术倍数增加， 几乎可以忽略不计， 这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。


PCR反应体系与反应条件

标准的PCR反应体系：

10×扩增缓冲液 10ul
4种dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10～100pmol
模板DNA 0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加双或三蒸水至 100ul

PCR： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、、模板和2+

： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

设计引物应遵循以下原则：

①引物长度： ，常用为左右。
②引物扩增跨度： 以为宜，特定条件下可扩增长至的片段。
③引物碱基：含量以为宜，太少扩增效果不佳，过多易出现非特异条带。最好随机分布，避免个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

引物量： 每条引物的浓度.～或～，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量。指总反应体积为时，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以或。的缓冲液将其调节到.～.，小量分装， ℃冰冻保存。多次冻融会使降解。在PCR反应中，应为～，尤其是注意种的浓度要相等等摩尔配制，如其中任何一种浓度不同于其它几种时偏高或偏低，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。能与2+结合，使游离的2+浓度降低。

模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用和蛋白酶来消化处理标本。的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶法，要防止降解。

2+2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种浓度为时，2+浓度为.～.为宜。浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

PCR反应条件的选择

PCR反应条件为温度、时间和循环次数。

： 基于PCR原理三步骤而设置变性退火延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在～℃变性，再迅速冷却至～℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至～℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因长度为～时可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用℃变性，℃左右退火与延伸此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性。

①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，℃～℃足以使模板DNA变性，若低于℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。

②退火复性温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至℃～℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于个核苷酸，含量约的引物，℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
复性温度=Tm值-(5～10℃)
在值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为～，足以使引物与模板之间完全结合。

③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。

PCR反应的延伸温度一般选择在～℃之间，常用温度为℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般以内的DNA片段，延伸时间是足够 的。～的靶序列需～；扩增需延伸至。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在～次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带
　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。
　　酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
　　引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单 位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
　　Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
　　反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
　　物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
　　靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

假阳性
　　出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
　　引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
　　靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

出现非特异性扩增带
　　PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。

出现片状拖带或涂抹带
　　PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。

克隆PCR产物
1)克隆PCR产物的最优条件是什么？
最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4℃过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4℃过夜。

2)PCR产物是否需要用凝胶纯化？
如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。

3)如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？
A）涂布未转化的感受态细胞。
如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。
B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。
例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为： 产生菌落的总数/铺板DNA的总量。
铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA。转化率为：
1000克隆X10（3次方） ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug
转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞
如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。
C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生>20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ ug感受态细胞），表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。
D）用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生>20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。

4)对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？
A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4℃过夜。
B）插入片段带有污染，使3`-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。
C）插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。
D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料（TM042）。
E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞

PCR反应体系与反应条件
标准的PCR反应体系：
　　　　　　 10×扩增缓冲液 　 10ul
　　　　　　 4种dNTP混合物 　 各200umol/L
　　　　　　 引物 　　　　 　 各10～100pmol　
　　　　　　 模板DNA 　　　 　0.1～2ug　
　 　　　　　Taq DNA聚合酶 　 2.5u　
　　　　　　 Mg2+　　　　　　 1.5mmol/L
　　　　　　 加双或三蒸水至 　100ul

　　PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
　　引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

　　酶及其浓度　目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

　　dNTP的质量与浓度　dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。

　　模板(靶基因)核酸　模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

　　Mg2+浓度　Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

　　PCR反应条件的选择
　　PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
　　温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。
　　①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
　　②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
　　　　　Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
　　　　　复性温度=Tm值-(5～10℃)
　　在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
　　③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
　　　　　　　　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
　　　　　　　　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子
　　　　　　　　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子
　　　　　　　　　高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。
　　PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
1.PCR反应的最适条件
4．1 TaqDNA聚合酶
在早期进行的PCR反应中，使用的是大肠杆菌DNA聚合酶1的大片段，，即Klenow片段。也曾有人用噬菌体T4 DNA聚合酶。这两种酶的共同弱点是对热不稳定性，DNA合成反应只能在370C进行。PCR时每一循环的解链温度都在90C以上进行，故在每两个循环之间要加入新的DNA聚合酶，使得整过程整个实验过程很繁琐和昂贵。同时在370C，引物与DNA模板之间会发生分子非特异性结合，最终导致很多非特异性DNA片段的扩增。
Taq 酶有耐高温的特性，其最适的活性温度是720C（75-80），连续保温30分钟仍具有相当的活性，而且在比较宽的温度范围内都保持着催化DNA合成的能力，一次加酶即可满足PCR操作过程自动化的实现。
（1） TaqDNA聚合酶的热稳定性及最适延伸温度
相对分子质量为94000的TaqDNA聚合酶的酶活性较高，大约为200000Umg，在合成时有一个较高的最适温度75-80C，转换数Kcat接近150nt/(s•酶分子)。这种活性有明显的温度依赖性。TaqDNA聚合酶虽然在90C以上合成DNA的能力有限，但高温时仍比较稳定。有人试验证明在92.5C,95C,和97.5C时，PCR混合物中的TaqDNA聚合酶分别经130分钟、40分钟和5-6分钟后仍可保持50%左右的活性，其半衰期较长。所以，在一个PCR预备试验中，每次循环时上限温度为95C（试管内）处理20秒，则循环50次后TaqDNA聚合酶仍可保持65%的活性，能够保证实验的需要。
TaqDNA聚合酶具有很高的加工合成特性，其最适延伸温度在75-80C时，dNTP的掺入速度为35-100nt/(•酶分子),最长延伸长度7。6kb，如对M13上的富含GC的30-me引物，该酶在70C的延伸率高于60nt/(•酶分子), 在55C仍有较高的延伸活性，22C和37C时延伸速度分别为0。25和1。5 nt/(•酶分子)。由此可见，在低温下，TaqDNA聚合酶一表现活性明显降低，因而，导致此酶在模板链分子内局部二级结构区域的延伸能力受损或前进速率常数与解离常数的比值发生改变。在很高的温度（90C以上）时，很少DNA合成。在体外条件下，DNA在较高温度时的合成速度受到引物或引物链与模板链的双链结构稳定性的限制。温度对TaqDNA聚合酶活性的影响见表。
由于TaqDNA聚合酶的最适延伸温度高达75-80C，故退火和延伸反应温度均可提高，限制了非特异性扩增产物的出现，增加了PCR的特异性。

4．2 模板
（1） 模板的纯度 一般不要求很高，不需要达到超纯。某些扩增实验中甚至可以直接将溶细胞液煮沸加热，用蛋白质变性后的DNA溶液作模板。但DNA溶液中不能有影响扩增反应的物质存在，例如蛋白酶、核酸酶、结合DNA的蛋白质等；另一类是尿素、十二烷基硫酸钠、卟啉类物质等；还有一类是二价金属离子的络合剂（如EDTA）等，会与Mg2+络合，影响Taq DNA聚合酶的活性。上述物质的存在会影响扩增效果，甚至使扩增失败。
（2） 模板DNA的量 一般对于单拷贝的哺乳动物基因组模板来说，100ul的反应体系中有100ng的模板已足够。有时，加的模板太多，会令扩增失败。这时如果对模板稀释后再加入反应体系中，往往能获得成功。
4．3 dNTP
dNTP储备液必须为PH7.0左右,浓度一般为2mmol/L, 分装后置-20C保存.典型的PCR扩增体系中,两种dNTP的终浓度为20-200umol/L. 理论上,100ul反应液中两种dNTP的浓度为20umol/L时,足以合成12.5ug DNA或合成10pmol 400bp的DNA片段. DNTP会络合溶液中的 Mg2+, 而且大于200umol/L的dNTP会增加Taq DNA聚合酶的错配率.如果dNTP的浓度达到1mmol/L时,则会抑制Taq DNA聚合酶活性.
4．4 Mg2+浓度
Taq DNA聚合酶在合成新DNA链时,要求有游离的Mg2+,因而在PCR系统中确定Mg2+的最适浓度是必要的. Mg2+浓度太低会无PCR产物,太高又会导致非特异的产物产生. 故常需根据各自的实验预先试验,以确定本实验的最佳Mg2+浓度,保证DNA聚合酶具有良好的活性.
通常情况下,要求反应体系中有0.5-2.5mmol/L的游离Mg2+.反应内容物中, dNTP能与Mg2+.结合,所含EDTA会与Mg2+络合,高浓度的DNA也有干扰作用,都会影响Mg2+的有效浓度.
4．5 PCR系统中的其它成分
PCR反应缓冲溶液通常用10 mmol/L Tris-HCl(PH8.3, 20C), 它是两性离子缓冲剂.此外,还有50 mmol/L KCL, 它有利于引物与模板退火.高于50mmol/L 的KCL, 或50mmol/L 的NaCl对Taq DNA聚合酶有抵制作用.明胶或血清白蛋白(100ug/ml)及非离子去污剂,如Tween20等,对Taq DNA聚合酶起稳定作用.
4．6 PCR的热循环计划
在标准反应中,将标本加热至90-95C,使DNA双链变性, 再快速冷却至40-60C使引物退火并结合到互补靶序列上,然后升温至70-75C, 在Taq DNA聚合酶的作用下掺入单核苷酸使引物沿模板延伸.每步时间从反应达到要求温度后计算. PCR反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性引物退火和反应延伸3个步骤组成的.图中设定的反应参数是94C变性1分钟,60C退火1分钟,72C延伸1.5分钟.如此周而复始,重复进行,直到扩增产物的数量满足实验需求为止.
(1) 变性温度与时间 使靶基因模板和PCR产物完全变性是PCR成败的关键.DNA在其链分解温度时的变性只需几秒钟,但反应管内达到Tss还需一定时间,变性温度太高会影响酶活性;通常情况下94-95C变性1分钟就足以使模板DNA完全变性,更高的温度可能更为有效(尤其是富含C+G的靶基因),若低于94C,则需延长变性时间.为提高起始模板的变性效果,保存酶活性,常常在加入Taq 酶之前97C先变性7-10分钟,再按94C的变性温度进入循环方式,这对PCR的成功有益处.
(2) 复性温度与时间 复性温度决定着PCR的特异性.引物复性所需的温度与时间取决于引物的碱基组成、长度和浓度。合适的复性温度应低于扩增引物在PCR条件下真实Tm值的5C，引物越短（12-15bp）,复性温度越低（40-45C）。一般来说，若降低复性温度（37C），可提高坟增产量，但引物与模板间错配现象会增多，导致非特异性扩增上升；若提高复性温度（56-70C），虽扩增反应的特异性增加，但扩增效果下降。理想的方法是：设置一系列对照反应，以确定扩增反应的最适复性温度。
（3）延伸温度与时间 Taq DNA聚合酶虽能在较宽的温度范围内催化DNA的合成，但不合适的温度仍可对扩增产物的特异性、产量造成影响。引物延伸温度一般为72C（较复性温度高10C左右），延伸时间视目标DNA片段长短和浓度而定。在最适温度下，核苷酸的掺入率为35-100nt/s，这也取决于缓冲体系、PH值、盐浓度和DNA模板的性质等，延伸1分钟对长达2kb的扩增片段是足够的，延伸时间过长会导致非特异扩增带的出现，但在循环的最后一步延伸时，为使反应完全，提高产量，可将延伸时间延长4-10分钟。
（4）循环数 循环数决定着扩增程度，常规PCR一般为25-40周期，在其他参数交已优化的条件下，最适循环数取决于靶序列的初始浓度，其相应关系参照下表
模板DNA分子数 需要热循环次数
3．0×105 25-30
1．5×104 30-35
1．0×103 35-40
50 40-45
循环次数太少，得不到一定的产物量；循环次数太多时，扩增反应的后期，产物积累的指数率下降甚至不再有正确的产物生成，正常的反应几乎停止，呈现平台效应。
影响出现平台效应的因素有：
A、反应试剂（dNTP或酶）稳定性的改变；
B、终产物（如焦磷酸）的抑制效应；
C、产物浓度超过10-5时可产生重复退火，于是会降低引物延伸速率或DNA聚合酶的活性
D、高浓度产物DNA双链的解链不宝剑。平台效应时的一种重要后果是由于错误引导，在开始时浓度不高的非特异产物会继续扩增，使结果的分析复杂化。
4．3引物的要求：
（1） 一般长15-30bp，常用20bp（理论上420=11×1011长的DNA片段才会有重复）。引物过长，扩增的效率降低。
（2） 碱基组成：C+G占50-60%（常规），尽量避免数个嘌呤和嘧啶的连续排列。
（3） 一对引物之间不能有2个以上的碱基互补，特别是3‘末端；引物之间的碱基互补会形成引物二聚体，引物本身应避免回文序列。
（4） 引物与模板退火的温度和所需的时间取决于引物的碱基组成、长度和溶液中引物的浓度。合适的退火温度是低于引物本身的实际变性温度（Tm）50C。20bp左右长度的DNA片段的Tm=(G+C) ×40C+(A+T) ×20C。退火火温度通常在55-720C下进行在标准的引物浓度（0.2umol/L）下，几秒内即可完成退火。提高退火温度可提高引物与模板结合的特异性。特别在最初几次循环中采用严谨的退火温度，有助于PCR特异性扩增。如果引物中（G+C）的含量小于50%，退火温度应低于550C。
（5） 100ul的PCR反应液中，引物的绝对量为10-100pmol。PCR反应液中2个引物浓度不等时，其浓度比为50:1，称为不对称PCR。
简并引物：由多种寡核苷酸组成的混合物，彼此之间仅有一个或数个核苷酸的差异。若PCR扩增引物的核苷酸组成顺序是根据氨基酸顺序推测而来，就需合成简并引物。
嵌套引物：利用第一轮PCR扩增产物作为第二轮PCR扩增的起始材料，同时除使用第一轮的一对特异引物外，另加1-2个新引物（处在同一个模板DNA的头两个引物之间序列）进行第二轮扩增。通过嵌套引物扩增的产物，产生错误扩增的可能性极小，所以应用嵌套引物技术能够使靶DNA序列得到有效的选择性扩增。
PCR的的应用：基因克隆、反向PCR、不对称PCR、RT-PCR、基因的体外诱变和突变检测、基因组的比较研究

最主要的是在向PCR管内加液体时一定要注意污染问题，宁可多换几个移液枪（移液器）的枪头，也不要污染任何液体，因为任何一点的污染都会导致实验的失败。做空白对照的时候要保证PCR管内的液体体积相同，除模板外别的材料要加相同的量。

退火温度的摸索

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