pcr需要注意的问题

在做pcr的操作过程中需注意哪些问题？~

首先，在设计PCR引物时，结构要好，长度应在20bp左右，避免引物间形成引物二聚体。两条引物的退火温度尽量保持一致，最好是在55度左右。
其次，使用的DNA模板量是比较关键的，应使用纯度较高，基因组较完全，没有产生断链的基因组DNA。
然后是PCR体系中各个试剂的使用，比如说酶的纯度，活性，并且要注意酶量一定要适中，过尤不及。各DNTP的量要保持一致。PCRbuffer中要注意有无添加镁离子等帮助反应进行的东西。等等。
最后是PCR程序的设置。如果怕一开始就使用一个固定的退火温度扩增不出来，可以先小批量得试验温度梯度，或者用touchdown程序，即先设置一个较高的退火温度，这样引物的特异性结合会比较好，然后每个循环的退火温度都比上个循环低0.5度或1度，最终停留在某一个较合适的温度完成整个程序。
PCR反应中有太多细节要注意了。只能在试验中摸索，进步。
现在也有公司可以代做PCR，省时省力，大大缩短研究周期。
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太多了，比如一定要有阴性对照，防止污染带来的假阳性；退火温度的设置等等

1、PCR产物的电泳检测时间：一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。

2、假阴性，不出现扩增条带

模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。

酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增。

对策为：选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。

如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

3、假阳性

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。

所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

4、出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。

其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。

5、出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。

参考资料来源：百度百科-PCR扩增

实验操作注意事项：尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意：

1、戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套。

2、使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染。

3、避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面。

4、操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度。

扩展资料

CR由变性→退火→延伸三个基本反应构成：

1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。

2、模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。

3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

参考资料来源：百度百科——聚合酶链式反应

实验操作注意事项：尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意：

1、戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套。

2、使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染。

3、避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面。

4、操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度。

聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。

扩展资料：

PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合。

再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。

循环次数一般为25 ～ 30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的 扩增量。

但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。

参考资料来源：百度百科——聚合酶链式反应

PCR需要注意以下事项：

1.模板
尽量避免含有酶抑制剂！
2.引物
保存时间不易过长，要符合引物涉及的原则，在用软件设计结束后要进行适当的人工处理。引物浓度要合适，太高容易引起错配及非特异性产物的形成。
3.循环参数
一般退火温度应低于Tm值5℃。先循环数次，然后延伸几分钟，再进行循环，有时候可以加大产物的量
4.酶浓度
过高容易导致非特异性产物的形成
5.离子浓度
过高容易导致非特异性产物的增加
6.dNTP
浓度过高会抑制酶的活性，引起错配

希望对你有所帮助^_^

有些PCR仪器不是很稳定，建议你做梯度或者后继试验的时候，尽量将PCR管放在仪器的中间部分，同时仪器的四个角落可以放装满水的PCR管，这样可以使仪器温度相对稳定些。
同时加样的时候，尽量在冰上操作，引物和酶避免反复冻融。

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穆棱市15063901232： pcr需要注意的问题 - ？
恽蚂西黄：[答案] PCR需要注意以下事项: 1.模板 尽量避免含有酶抑制剂! 2.引物 保存时间不易过长,要符合引物涉及的原则,在用软件设计结束后要进行适当的人工处理.引物浓度要合适,太高容易引起错配及非特异性产物的形成. 3.循环参数 一般退火温度应低于...

穆棱市15063901232： PCR实验过程中的注意事项 - ？
恽蚂西黄：[答案] PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚至消失. PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及, ④PCR循环条件.寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究. ...

穆棱市15063901232： 我想问做PCR扩增应该注意的事项? - ？
恽蚂西黄：[答案] 注意] 1、整个操作要带口罩及一次性手套,并尽可能在低温下操作. 另外,提取上清这步一定要小心,靠近沉淀的部分一定要舍得不要,要不然会有蛋白质污染,影响比值 2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上,RNA沉淀在70%乙醇中可在...

穆棱市15063901232： 在PCR扩增实验中应注意什么? - ？
恽蚂西黄： 1. 引物的质量是保证PCR特异性的关键,引物过长或过短均会使特异性降低,以18~30bp为宜;引物中C+G含量宜在50%左右;引物内部和引物之间不应含有互补序列;引物的碱基顺序与非扩增区域的同源性应小于70%;引物的3'末端与模板...

穆棱市15063901232： PCR仪使用的注意事项 ? - ？
恽蚂西黄： 尽量不要将样品低温保存过夜,因为PCR仪器最核心的部分其实就是压缩机,这样会缩短它的寿命!我们实验室用的ABI公司的一代产品现在都7年多了还是很好用!

穆棱市15063901232： PCR实验过程中的注意事项 - ？
恽蚂西黄： PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚至消失. PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及, ④PCR循环条件.寻找原因亦应针对上述环节进行分...

穆棱市15063901232： PCR操作时注意事项 - ？
恽蚂西黄： 1. PCR引物设计: 引物设计可能是PCR扩增成功最关键的因素.如引物设计欠佳,可能导致扩增产物不足,甚至扩增失败,其原因是设计欠佳的引物可导致非特异扩增和/或形成引物二聚体,此又成为PCR反应的竞争性产物,从而进一步抑制...

穆棱市15063901232： 在做pcr的操作过程中需注意哪些问题 - ？
恽蚂西黄： 在做pcr的操作过程中需注意哪些问题 原理:DNA双连复制 条件:已知目的基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA聚合酶 DNA变性,氢键断开,成单链DNA 退火,形成局部双链 延伸 特点:成指数形式扩增

穆棱市15063901232： PCR扩增DNA的注意事项是什么? - ？
恽蚂西黄： 一、温度循环参数(老师会给你设定好) 二、引物引物设计(老师会给你设定好),三、退火步骤的严格性:提高退火温度可以减少不匹配的杂交,从而提高特异性.②减短退火时间及延伸时间可以减少错误引发及错误延伸.

穆棱市15063901232： 进行一次成功的PCR反应顺注意哪些问题 - ？
恽蚂西黄： 1、引物设计要准确,2、模板没有问题,3、加样问题不大,基本有一点都能P出来的,这个是靠练的,只是说说起不了作用.找一个你们实验室经常用的体系,做一下.再一个,有时候PCR反应的各物品要完全解冻,否则可能影响加入量的不准确!TM值设定的话,做不出来,可以简单做一个TD就好了.