荧光PCR绝对定量的标准曲线倍比稀释梯度一直不理想（用的进口枪头），从9次方稀释到0次方，2就不好了
间隔也很小，都在0.4左右-----估计你没有扩出目的DNA片段，检测到的信号都是引物二聚体跟SYBR结合的结果。
我怀疑你的PCR条件还没调整至最佳条件。你先用浓度最大的那个质粒做模板，进行定性PCR，然后跑电泳，观察是否有目的条带，是否有引物二聚体。记住，有引物二聚体的话，引物二聚体就会和SYBR结合，这样做realtimePCR是不准的。一定要调整至没有引物二聚体，可以考虑提高退火温度及降低引物浓度。
调整好之后，质粒用PCR水做10倍梯度稀释（比如4微升稀释至40微升），如果扩增效率没问题的话，理论上质粒浓度每差10倍，其ct值就相差3.3。另外，如果体系调整好之后，你的质粒最小的还是在26以上的话，最低只能稀释到100倍了，再低就做不出来了
荧光原位杂交和荧光定量PCR有什么区别
实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5;-3;)的方向合成互补链。
恒温PCR和实时荧光定量PCR的不同，是不同在实时荧光定量PCR的系统中加入了荧光染料（SYBR Green 或Taqman 探针等等）。以SYBR Green为例，这种染料可以结合在双链的DNA上，当PCR不断进行时，每一次退火生成的双链DNA也在增加，荧光染料结合也越多，荧光也越强。在机器中有一个探测荧光的探头，可以定量检测荧光的强度，转换成数值。这样就可以实时记录反映体系中DNA的反应情况。
荧光PCR更有优势，因为荧光PCR灵敏度高于恒温PCR，同样价格也高一些。
2.查看溶解曲线，看是否是单一尖峰，以判断引物是否合格
3.看扩增条件是否合适
4.看循环数是否在合理的区域内，控制稀释条件
5.锻炼自己的加样能力，又快又好
我是来不耻下问的。绝对定量有必要次次都做标准曲线吗？你师姐做的标曲不能用吗？
标准曲线想做的漂亮也不是很容易的，注意加样的差异吧，孔和管的差异也很大，毕竟那么微量的东西
一文知晓PCR,定量PCR,数字PCR方法选择
这款产品采用了高能LED作为光源系统，可保证光源强度高，光源一致性好；高品质的帕尔贴温度模块作为温控系统，升降温速率快，可设置12列跨度30°C的温度梯度；卓越的CMOS拍照+光纤信号传输作为检测系统，CMOS检测灵敏度高，光纤传输速度快，无光损失和干扰。Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统可为您的...
荧光定量PCR(一)— 基础介绍
由于目前不同荧光定量PCR仪的原理和提供的检测光光谱范围的差异，因此在选择探针的发光基团和淬灭基团时一定要根据所用的仪器型号设置的可检测的荧光信号范围内选择（探针法可连接我们的荧光定量PCR试剂盒的编号及对应的机器型号）由淬灭基团TAMRA、Eclipse或BHQ系列染料组成的双标记荧光探针常常被用作水解探针...
那位大侠能解释一下相对定量和绝对定量PCR的区别
绝对定量是确定准确的拷贝数 而相对定量只是确定样品相当于标准品有多少量，
荧光定量PCR仪ABI7500数据怎么分析
做绝对定量的话横坐标是初始模版的拷贝数，纵坐标是CT值
荧光定量PCR中的IPC和IAC的区别
2.内参又是指什么呢，内参和阳性内参有什么区别呢，是不是即有用对数据进行校正的，还有用于监控反应体系防止假阴性现象的。3.一般进行探针法荧光定量PCR时是不是最好采用内标来监控反应体系呢，如果不适用的话，对实验有什么影响么？ps：我是做绝对定量的。4.如果需要用内标的话，我原来一个师兄建议...
RT-PCR的原理是什么?有何用途?
也就是说经过计算，达到检测限的循环数就能反映初始RNA样品中某种RNA的含量多少。 在实际中，使用了特殊的含有荧光剂的引物，光学检测相应光强度的产物所需的循环数，能高度灵敏的达到目的。 realtime-PCR有两种。绝对定量和相对定量。 绝对定量常用于逆转录病毒侵染细胞的检测。用途：通过逆转录，以及taq...
荧光定量pcr原理
荧光定量pcr原理如下：荧光定量PCR（Real-time PCR），是指在PCR扩增反应体系中加入荧光基团，通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。以探针法荧光定量PCR为例：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针两端分别标记一个...
如何将DNA进行绝对定量?
首先想确定一下楼主说的DNA绝对定量指的是？定量PCR，是分析某个样本中特定序列的数量。比如cDNA中某个片段的拷贝数。核算蛋白标定仪，如果这个指的是Biophotometer，测A260,A230,A280的话测的是DNA浓度，也就是说不管什么片段，不管什么长度，测出来的是总的DNA含量。如果说第二个，我现在想不到更好...
相对定量中的内参能用在荧光PCR绝对定量中做内参吗
不需要，PCR中引物都是过量加的，而且定量PCR是看Ct值的，所以在一定范围内不影响定量的结果
实时荧光定量 PCR
实时荧光定量 PCR ,简称 RT-QPCR, 属于 Q-PCR 的一种,目前该技术已得到广泛应用,如:扩增特异性分析、基因定量分析、基因分型、 SNP 分析等。荧光定量 PCR 常用的方法是 DNA 结合染料 SYBR GreenⅠ的非特异性方法。 SYBR Green I 是一种结合于所有 dsDNA 双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的荧光染料, 可与所...
卷质孚来： 1.最好每次都做标准曲线.在益阳的情况下,天气、机器等不适很稳定 2.查看溶解曲线,看是否是单一尖峰,以判断引物是否合格 3.看扩增条件是否合适 4.看循环数是否在合理的区域内,控制稀释条件 5.锻炼自己的加样能力,又快又好
静安区18482676720： 绝对荧光定量pcr标准品怎样稀释? - ？
卷质孚来： 采取大体积稀释法,就是总的样品取1+9、1+99...每次的母液都是取自总的样品中,这样能好一点
静安区18482676720： 荧光定量pcr扩增曲线怎样才算好 - ？
卷质孚来： 根据模板的来源不同选择不同的标准品,且浓度已知.标准品可以自己制备也可以购买. 然后在进行定量的时候对标准品进行浓度梯度稀释(5倍/8倍/10倍),由于CT值跟浓度的负对数存在线性关系,所以根据CT值和已知的浓度画出标曲.一般情况下机器会自动给出标曲.
静安区18482676720： 荧光定量PCR 标准曲线 - ？
卷质孚来： 具体情况要看你做的这个基因在两个物种中的同源性.如果同源性很高,可以用同一对引物,同一条探针的话,那我们就认为它在realtimePCR中的扩增效率是一样的,标准曲线只要做一次就行了,对数据分析不会有影响
静安区18482676720： 请问大家这是荧光定量pcr中的什么图呀,能解释下吗?多谢了 - ？
卷质孚来： 这是标准曲线.利用你的cDNA进行梯度稀释,一般是对倍稀释,去跑realtime PCR,得到的数值就可以画出这样对应的图.一般的PCR机器都有这个功能,可以自行生成.得到的曲线一个是检测你自己的操作有没有问题,一个是检测你的引物有没有问题.然后利用这个标准曲线可以标定你的未知cDNA的浓度.不知这样有没有说清楚.
静安区18482676720： 荧光定量PCR绝对定量时的标准曲线优劣的判断指标有哪些呢? - ？
卷质孚来：[答案] 扩增效率E和 R的平方
静安区18482676720： 如何用rtpcr定量her2拷贝数 - ？
卷质孚来： 半定量pcr内参基因扩增条件和目的基因扩增条件一样以参照物为标准,对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测,从而达到评估样本中靶基因的拷贝数,称为定量PCR.根据反应体系是否设有参照物以及是否与标本在同一管中进行扩增,...
静安区18482676720： 实时荧光定量PCR的结果该怎样分析? - ？
卷质孚来： 1、如果有标准曲线,按照标准曲线计算; 2、一般都是相对量,则用delta delta CT方法来计算; 3、引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性; 4、模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起; 5、看CT值是分析...
静安区18482676720： 荧光绝对定量中标准品指的是什么,如何获取 - ？
卷质孚来： 荧光绝对定量中标准品:指用含有目的基因的质粒,知道质粒的分子量和浓度计算出拷贝数,然后倍比稀释就作为绝对定量的标准品. 获取:把目的基因p出来,然后接到质粒上,转染摇菌扩增,然后再抽质粒,酶切纯化.最后把纯化的目的...
静安区18482676720： 荧光定量PCR绝对定量时的标准曲线优劣的判断指标有哪些呢?谢谢! - ？
卷质孚来： 扩增效率E和 R的平方
