你好，我想问一下，有关琼脂糖凝胶电泳的问题。
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖凝胶电泳常见为题都有哪些？
DNA带模糊
DNA降解：琼脂糖凝胶电泳试验中要避免核酸酶污染
电泳缓冲液陈旧：电泳缓冲液多系使用后，离子强度降解，PH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳实验，建议经常更换电泳缓冲液。
所用电泳条件不合适：电泳时电压不应超过20V/cm，温度<30℃；巨大DNA链电泳，温度应该<15℃；检车所有电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力
DNA上扬量过多：应减少凝胶中DNA上样量。
DNA样含盐量过高：电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。
有蛋白污染：电泳前酚抽提去除蛋白
不规则DNA带迁移
对于λ/HindⅢ片段cos位点复性：电泳前于65℃加热DNA5分钟，然后在冰上冷却5分钟。
电泳条件不合适：电泳电压不超过20V/cm；温度<30℃；经常更换电泳缓冲液。
DNA变性：以20mM NaCI Buffer稀释DNA，电泳前勿加热。
带弱或无DNA带
DNA的上样量不够：增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低。
DNA降解：避免DAN的核酸酶污染
DNA走出凝胶：缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。
对于EB染色的DNA，所用光源不合适：应用短波长（254mm）的紫外光源
DNA带缺失
小DNA带走出凝胶：缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。
分子大小相近的DNA带不易分辨：增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度。
DNA变性：电泳前请勿高温加热NDA链，以20mM NacI Buffer稀释DNA
DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适：在脉冲凝胶电泳上分析。
综上所诉，琼脂糖凝胶电泳实验需注意以下几点：
1.体系配制时候最关键的几个试剂一定要确定它们还有效、或者还没被污染：引物，酶，超纯水。这些东西最好自己收好，写上个人的名字放好，冰盒上记得带上橡皮筋，这样就不会因为别人翻冰箱时候把你的冰盒碰散了，试剂都碰掉。否则，你的试剂被污染了，到时候阴性对照狂出条带，再去找污染源很麻烦。而且配置体系时候要注意保持实验区的干净，事先可用小喷壶进行酒精喷雾，固定空气中的DNA，而且全程要戴手套，避免污染体系。
2.pcr体系要摸准，最好用人家都做得很多的老体系来上手。
3.要想得到漂亮的电泳图，可以在PCR开始时候就把胶倒上（前提是你的PCR总时间在1.5小时左右，并且1.5小时候之后你还在实验室。），让凝胶凉着，这样凝胶的上样孔会比较规则，胶体里面的其本身的孔径也会较规则。如果你要第二天再跑胶，千万记得把PCR完毕的样本放入4℃保存。第二天做时候建议把胶凉上25分钟左右。
4.琼脂糖凝胶电泳上样时候建议使用排枪上样，不仅快速而且样本加到胶孔里的速度一致。当然，排枪上样最好选用进口枪头，国产枪头就不要想了。
5.不管电泳室使用的频率高还是低，我都建议每次琼脂糖凝胶电泳时候更换电泳液，避免出现“＾”形条带。
提取的时候饱和酚，氯仿需要定量，这些可以去蛋白。去除rna污染，rna酶活性，定量。凝胶电泳，试剂最好是即用型的，因为有些东西放久了会长菌。然后是染料的热稳定性和灵敏度。。。
琼脂糖凝胶电泳只能分离20KD一下的片段？首先这个表述有问题，不是20KD，KD是描述蛋白分子量的，应该是DNA或者RNA片段20kb吧，
琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。
0.3%的琼脂糖凝胶，跑总DNA是可以，但要注意电泳时间，不能太长。
一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。
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何全施捷： 琼脂糖凝胶电泳只能分离20KD一下的片段?首先这个表述有问题,不是20KD,KD是描述蛋白分子量的,应该是DNA或者RNA片段20kb吧,琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段...
江阳区13151352815： 什么是琼脂糖电泳的?其基本知识及操作方法是什么?不同形态的DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的大小如何分布或者改变? - ？
何全施捷： 以琼脂糖凝胶作为支持介质的电泳称为琼脂糖凝胶电泳. 二、琼脂糖凝胶电泳的准备和操作方法 1 、制备琼脂糖凝胶时注意避免产生气泡 凝胶电泳分为垂直型和水平型,一般垂直型分离效果好于水平型.但水平型可制备低浓度琼脂糖,制胶和...
江阳区13151352815： 琼脂糖凝胶电泳是从负极到正极跑吗 - ？
何全施捷： 琼脂糖凝胶电泳是从负极到正极. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动,电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低,当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳. 扩展资料: 琼脂糖是一种线性多糖聚合物,是从红色海藻产物琼脂中提取而来的.当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质,其密度是由琼脂糖的浓度决定的.经过化学修饰的低熔点(LMP)的琼脂糖,在结构上比较脆弱,因此在较低的温度下便会熔化,可用于DNA片段的制备电泳. 参考资料来源:百度百科-凝胶电泳
江阳区13151352815： 能介绍一下琼脂糖凝胶电泳技术吗? ？
何全施捷： 普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.220kb,利用脉冲电泳,可分离高达10^7bp的DNA片段
江阳区13151352815： 琼脂糖凝胶电泳有哪些注意问题 - ？
何全施捷： 1.体系配制时候最关键的几个试剂一定要确定它们还有效、或者还没被污染:引物,酶,超纯水.这些东西最好自己收好,写上个人的名字放好,冰盒上记得带上橡皮筋,这样就不会因为别人翻冰箱时候把你的冰盒碰散了,试剂都碰掉.否则,...
江阳区13151352815： 琼脂糖凝胶电泳marker的作用 - ？
何全施捷： 你好,琼脂糖凝胶电泳marker是用来做参考的,类似于标尺的作用. marker会跑出很多条带,对应带的片段长度是一定的(不同的marker,不同,可以查询);通过找到与样品平齐的带,可以间接地判定样品的片段长度. 这是我个人的理解,不知道描述清楚了没.
江阳区13151352815： 琼脂糖电泳有何优缺点? - ？
何全施捷： 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法.对于分子量较大的样品,如大分子核酸、病毒等,一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离. 琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段,其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低...
江阳区13151352815： 琼脂糖凝胶电泳使用哪种电压的电泳仪 - ？
何全施捷： 不用那么高你又不跑PAGE琼脂糖一般都不用超过220V一般如果是只调电压的那种150V左右足够用了如果是电流和电压同时调的50ma,100~120V就可以
江阳区13151352815： (急问)DNA琼脂糖凝胶电泳失败原因?取的DNA样品和标准样是和其它组合用的,电源也是和别得组合用,首先排除试剂和仪器问题,但最后在紫外灯下... - ？
何全施捷：[答案] 你的 DNA标准都没出来么?一个可能的原因 凝胶没有用缓冲溶液配制.如果不是这个原因 那么只有一种可能(我看最可能的):点样量少,电泳时间太久,本该有的条带弥散了 或者已经跑出去了.我把你的图片处理了一下 看见了...
江阳区13151352815： 琼脂糖凝胶电泳操作应注意哪些环节 - ？
何全施捷： 1. 根据片段大小配制不同浓度的胶(改变分辨率),片段越小,需要胶浓度越大. 2. 胶要现制先用. 3. 选择合适的Marker. 4. 配胶的缓冲液与电泳缓冲液要是同一种,且浓度一致(1倍). 5. 点样时要加入loading buffer,并注意,不要将样点到点样孔之外(飘样),也不要将胶戳漏(漏样). 6. 根据片段大小,及电泳检测目的,选择合适的电压及电泳时间. 7. EB染色.可选择制胶时加入EB(要在溶玩胶后,且温度至室温时(用手握住制胶容器,不烫手即可));或电泳结束后,将胶放入EB溶液中染色.
