什么是解链温度?影响特定核酸分子tm值大小的因素是什么
DNA熔解温度,指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。不同序列的DNA,Tm值不同。DNA中G-C含量越高,Tm值越高,成正比关系。
核酸Tm值(解链温度)计算
A variety of factors affect the efficiency of hybridization between two strands of DNA. These include the nature of the hybridizing molecules (DNA or RNA), their lengths, the hybridization environment (salt concentrations and denaturants), probe concentrations, and their sequences.
For membrane bound targets and moderately long DNA probes, Howley et al1 determined that the melting temperature (Tm) at which 50% of a probe is annealed to its complementary strand is defined by:
Tm = 81.5 + 16.6logM + 41(%G + %C) - 500/L - 0.62F
where
M = molar concentration of monovalent cations
%XG or C = the respective fraction of G and C nucleotides in the probe
L = length of the annealed product
F = molar concentration of formamide
For example, a short oligonucleotide probe with the sequence AGGTCATTG in a 75 mM solution without formamide has a predicted Tm = 81.5 + 16.6log(0.075) + 41(0.33+0.11) - 500/9 - 0.62(0)
= 24.1°C
This equation is inappropriate for probes less than about 50 nucleotides. Modifications of this equation include,
Tm of RNA = 79.8+18.5logM+58.4(%G+%C)+11.8(%G+%C)2-820/L-0.35F
Tm of an RNA-DNA hybrid = 79.8+18.5logM+58.4(%G+%C)+11.8(%G+%C)2-820/L-0.50F
The larger numbers reflect the increased stability of hybrids formed with RNA.
For oligonucleotides, Wallace, et al2 determined that
Td=2(A+T)+4(C+G), where Td = temperature (in °C) at which 50% of the oligonucleotides are annealed to their membrane-bound complementary sequences. The number of each particular nucleotide in the probe is inserted into the equation in place of the letters. The equation is useful for short (14-20 mers) in 0.9 M NaCl.
ex: for sequence AGGTCATTG, the Td = 2(2+3)+4(1+3) = 26°C
When the target and probe are free in solution, add 7-8°C to Td.
Melting temperature in solution is determined by plotting O.D versus temperature. The mid point on the S-shaped curve is the melting temperature.
Other estimates of melting points have been determined for DNA3 or RNA4 based on nearest neighbor analysis (reviewed by Genosys5). Breslauer, et al3 showed that melting behavior of a DNA duplex is predictable from its primary sequence.
Here,
Tm = 1000(DH)/[A+DS)+Rln(Ct/4)]-273.15+16.6log(Na+)].
where
DH = the sum of nearest neighbor enthalpy changes moving one base at a time through the sequence
A = correction for initiation of pairing (= -10.8)
DS = the sum of nearest neighbor entropy changes
R = 1.987 cal deg-1 mol-1)
Ct is the molar concentration of strands.
For self-complementary strands, the term "Ct/4" is replaced by Ct.
The values for DH and DS are shown in the table.
Nearest Neighbor DH DNA (kcal/mol) DH RNA (kcal/mol) DS DNA (cal/mol); DNA DS RNA (cal/mol)
AA or TT - 9.1 - 6.6 -24.0 -18.4
AT - 8.6 - 5.7 -23.9 -15.5
TA - 6.0 - 8.1 -16.9 -22.6
CA or TG - 5.8 -10.5 -12.9 -27.8
GT or AC - 6.5 -10.2 -17.3 -26.2
CT or AG - 7.8 - 7.6 -20.8 -19.2
GA or TC - 5.6 -13.3 -13.5 -35.5
CG -11.9 - 8.0 -27.8 -19.4
GC -11.1 -14.2 -26.7 -34.9
GG -11.0 -12.2 -26.6 -29.7
As an example, a 1 µM solution of the probe mentioned above (AGGTCATTG) in a 150 mM solution has a predicted Tm of:
Tm = 1000(-7.8-11.0-6.5-5.6-5.8-8.6-9.1-5.8) / [-10.8+(-20.8-26.6-17.3—13.5-12.9-23.9-24.0-12.9) + 1.987ln[(1E-06)/4]] - 273.15 + 16.6log(0.15)
= [-60900 / (-10.8-151.9-30.2)] - 273.15 - 13.7
= (-60900/-192.9) - 286.9
= 29°C
The applicability of these equations to laboratory situations varies as additional components in the hybridization environment are altered. It is best to consider these predictions guidelines, since they may vary for particular sequences from empirically derived determinations.
Background Problems
Moderate background on filter hybridizations is common. They often can be reduced by washing in up to 7% SDS.
Tm值的影响因素如下:
(1)G—C的含量:在一定条件下Tm高低由DNA分子中的G-C含量所决定。G-C含量高时,Tm值比较高,反之则低。这是因为G-C之间的氢键较A-T多,解链时需要较多的能量之故。
Tm值和G-C的含量可用二一个经验公式表示:
(G—C)%=(Tm-69.3)×2.44
在一定条件下(pH7.0,0.165MNaCl中)Tm值与(GC)%含量呈正比关系。因此,通过测定Tm值,可以推算出DNA分子中的碱基百分组成。
(2)DNA所处的溶液条件:DNA溶液中离子强度低时,Tm较低,而且熔解温度范围较宽;离子强度较高时,Tm较高,熔解温度范围较窄。因此,在表示某一来源DNA的Tm值时,必须指出其测定条件。
扩展资料:
Tm值的计算:
对于寡核苷酸(oligonucleotides),Tm的计算可以做到基本准确。为了方便计算,我们忽略氢键部分形成的情况。
不妨假设有两个核苷酸A和B,分别在不同的单链DNA上,形成双链的过程可以表示为:
反应的平衡常数可知为:
根据范德霍夫等式可得
由熔解温度的定义可得
又由于
因此Tm也可表示为:
参考资料来源:百度百科-Tm值
参考资料来源:百度百科-熔解温度
影响因素:
G+C比例越高,Tm值越高。
Tm=4(G+C)+2(A+T)
Tm值为PCR反应退火温度的重要参考依据。
通常将加热变性使DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称为该DNA的熔点或溶解温度(melting temperature),用Tm表示。当达到Tm时,DNA分子内50%的双链结构被打开,即增色效应达到一半时的温度,它在S型曲线上相当于吸光率增加的中点处所对应的横坐标。
引物的TM值如何计算
Tm(解链温度)是指50%双链被解开成单链时的温度。寡核苷酸浓度和盐浓度会影响Tm值的大小。Tm 值 有 多 种 计 算 方 法 。我 们 使 用 近 邻 法 ( P N A S 8 3 ,3 7 4 6- 5 0 )来计算。用这种方法计算前,也有多种方法来估测。如果是15个碱基以下,那么有一种...
哪些因素会影响DNA变性的温度?
①DNA碱基组成:C-G含量越多,Tm值越高;A-T含量越多,Tm值越低。②溶液的离子强度:在低离子强度中,Tm较低,而且解链的温度范围较宽;在高离子强度中,Tm值较高,解链的温度范围较窄。③PH值:溶液的PH值在5~9范围内,Tm值变化不明显,当PH>11或PH<4时,Tm值变化明显。④变性剂:各种...
有哪些条件可影响PCR反应
①变性温度与时间:变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下,93℃~94℃min足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失败。②退火(复性)温度与时间:退火温度是影响PCR...
生化名词解释
解链温度:DNA在特定温度下解链的温度。核酸分子杂交:不同来源的核酸链通过互补序列结合形成双链。酶:生物体内的生物催化剂,包括蛋白质和核酸。酶的活性中心:酶中催化反应的关键区域,包含特定的活性基团。酶原激活:无活性酶转变为有活性状态的过程。同工酶:催化相同反应但有不同特性的酶类。米氏...
PCR技术扩增DNA过程中,解链温度的高低是由什么决定的?
解链温度是由片段长度和碱基构成决定的。片段越长,GC含量越高需要的解链温度越高。
孙乃恩的分子遗传学第10页最后一行, 为什么 写退火温度比解链温度...
因为解链的原理是利用DNA高温变性,使双链变成单链,便于作为模板与引物结合。所以解链温度更高,退火是为了让其复性,重新变为双链。
人体DNA的解链温度是多少
双链DNA的变性温度由其G+C含量来确定,含量越高解链温度也越高,,一般温度是94~95度
将双链DNA加热到解链温度,其紫外线吸收增加20%?
解链后减少了链内的氢键,影响了氧、氮与不饱和键的共轭。
DNA的解旋温度与(A+T)\/(C+G)的数值有什么关系
与(A+T)\/(C+G)相关的是DNA 的解链温度,也就是DNA拆分为两条单链温度。解旋和(A+T)\/(C+G)值无关。
解链温度名词解释
温度表的解释[thermometer;calorimeter] 测定温度的一种仪表 摄氏 温度表 详细解释 亦称“ 温度计 ”。测量温度的仪器。日常用的有体温表、寒暑表等。为一封闭玻璃细管,下端呈圆柱或圆球形,内注水银或酒精,形成液柱,随温度升降而伸缩,根据液柱顶端 所在 的刻度就可看出温度数值。刻度主要有摄氏(℃...
守胥东药: DNA的解链温度(Tm)是引物的一个重要参数,它是当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度,一种DNA分子的Tm值大小与其所含碱基中的G+C比例相关,G+C比例越高,Tm值越高. Tm=4(G+C)+2(A+T) Tm值为PCR反应退火温度的重要参考依据. 通常将加热变性使DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称为该DNA的熔点或溶解温度(melting temperature),用Tm表示.
榆林市19621808241: 生物化学 什么是dna变性和复性 - ?
守胥东药: 1.变性,这是DNA最重要的一个性质. ①DNA双链之间以氢键连接,氢键是一种次级键,能量较低,易受破坏,在某些理化因素作用下,DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂,使DNA双螺旋结构松散,变成单链,即为DNA变性.DNA变性只涉及...
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守胥东药:[答案] DNA的解链温度(Tm)是引物的一个重要参数,它是当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度,一种DNA分子的Tm值大小与其所含碱基中的G+C比例相关,G+C比例越高,Tm值越高. Tm=4(G+C)+2(A+T) Tm值为PCR反应退火温度的...
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守胥东药:[答案] DNA的解链温度(Tm)是引物的一个重要参数,它是当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度,一种DNA分子的Tm值大小与其所含碱基中的G+C比例相关,G+C比例越高,Tm值越高.Tm=4(G+C)+2(A+T)Tm值为PC...
榆林市19621808241: DNA解链温度和什么有关? - ?
守胥东药: G与C之间通过三个氢键相连,而A与T之间有两个氢键相连,解链是要破坏碱基对之间的氢键,所以GC含量越高的DNA,所需解链温度越高.
榆林市19621808241: 影响DNA解链温度的因素有哪些 - ?
守胥东药: 一、填空题1 .病毒 ΦX174 及 M13 的遗传物质都是单链 DNA .2 . AIDS 病毒的遗传物质是单链 RNA .3 . X 射线分析证明一个完整的 DNA 螺旋延伸长度为 3.4nm .4 .氢键负责维持 A-T 间(或 G-C 间)的亲和力5 .天然存在的 DNA 分子...
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守胥东药: 一、性质不同1、核酸的变性:在物理和化学因素的作用下,维系核酸二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏,DNA由双链解旋为单链的过程.2、降解,一般指有机化合...